綠色木霉β-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆

劉 穎，韓春然，張 帥，張瑋瑋，竇博鑫

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

纖維素酶是將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖的一組復(fù)雜酶系的總稱，細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物均能產(chǎn)纖維素酶[1-5]。其中β-葡萄糖苷酶（βglucosidase，纖維二糖酶或CB，EC3，2，1，21）能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖，防止纖維二糖的積聚，減輕其對(duì)纖維素酶的抑制作用，決定了纖維素糖化過程的最終效率，是促進(jìn)纖維素降解過程的關(guān)鍵酶，同時(shí)它也能水解其他有重要生理作用的β-葡萄糖苷[6-8]。但是β-葡萄糖苷酶含量卻最低，不足1%，且活性普遍偏低，是纖維素酶解轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[9]。許多國內(nèi)外學(xué)者正致力于β-葡萄糖苷酶分子生物學(xué)方面的研究，以期改善纖維素酶的催化效率，實(shí)現(xiàn)纖維素資源的高效生物轉(zhuǎn)化。天然纖維素酶由于酶活較低以及生產(chǎn)成本較高等因素的限制，大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用有一定的困難，對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行克隆，利用基因工程手段構(gòu)建高效纖維素酶產(chǎn)生菌越來越受到人們的重視，同時(shí)也為纖維素酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新途徑?，F(xiàn)已在纖維素酶基因克隆方面取得了一定的研究進(jìn)展，研究者幾乎將已克隆的纖維素酶基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進(jìn)行了表達(dá)。目前已有數(shù)千種纖維素酶基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列被公布在GenBank、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）核苷序列數(shù)據(jù)庫、日本DNA數(shù)據(jù)庫（DDBJ）等共享數(shù)據(jù)庫中[10-14]。

實(shí)驗(yàn)首先利用綠色木霉（Trichoderma viride）的總RNA為模板，在GenBank上檢索β-葡萄糖苷酶基因（bglⅠ）DNA序列，根據(jù)檢索結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物。然后運(yùn)用PT-PCR進(jìn)行了擴(kuò)增bglⅠ片段，并將其與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109進(jìn)行測序研究。獲得綠色木霉β-葡萄糖苷酶基的相關(guān)基本信息，并與GenBank上檢索的β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色木霉Trichoderma viride AS3.3711 中科院微生物研究所；大腸桿菌JM 109、質(zhì)粒PMD18-T、RNA提取試劑盒、DNaseⅠ酶、RT-PCR試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA片段回收試劑盒、RNase A、限制性內(nèi)切酶 大連寶生物工程公司；過硫酸銨、TEMED、溴酚藍(lán)、溴化乙錠EDTA Sigma公司；SDS 濟(jì)南賽恩斯科技有限公司；Tris 上海伯奧生物科技有限公司；PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯（去皮切塊）300.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000m L、121℃滅菌20min。

Thermal Cycler PCR儀 美國BIO-RAD公司；JY5000型電泳儀 北京市君意機(jī)電技術(shù)有限公司；HLQ-C型空氣浴振蕩培養(yǎng)箱 天津?qū)嶒?yàn)儀器廠；UV1900型紫外分光光度計(jì)日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠色木霉總RNA的提取 綠色木霉起始菌體量為0.10g菌絲體，采用Trizol法提取其總RNA。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 從GenBank中查找β-葡萄糖苷酶基因（bglⅠ），根據(jù)bglⅠ（M 55080）基因的序列，應(yīng)用Primer Prem ier 5.0和Dnamen軟件分析基因內(nèi)部是否帶有該載體卡盒中的限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、HindⅢ、PstⅠ、SacⅠ、XbaⅠ的酶切位點(diǎn)[9，14-15]。引物合成由大連寶生物工程公司TaKaRa完成。最終確定引物序列如下：正鏈引物為5’-AGGAG TTGCG TGTTT GTCT-3’；反鏈引物為3’-AAACT GCTCG ACTAA CGCC-5’。

1.2.3 PCR擴(kuò)增目的基因 以綠色木霉的基因組cDNA為模板，用β-葡萄糖苷酶基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。PCR反應(yīng)體系如下：模板cDNA（0.1μg/m L）：1.00μL；正鏈引物（100pmol/L）：2.00μL；10×Buffer（1.0mmol/L）：5.00μL；反鏈引物（100pmol/L）：2.00μL；dNTP（1.0mmol/L）：8.00μL；Taq DNA聚合酶（5.0U/μL）：1.00μL；滅菌ddH2O：6.00μL；總體積：25.00μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性處理1min；94℃變性30s，50℃退火40s，72℃延伸90s，循環(huán)次數(shù)30次；最后72℃延伸7m in，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR產(chǎn)物回收 采用DNA回收試劑盒方法回收，PCR產(chǎn)物用電泳檢測。PCR產(chǎn)物回收后與dATP連接（72℃，30min），再與載體連接。

1.2.5 連接反應(yīng) 在微型離心管中，加入1.0μL PMD 18-T Vector，3.0μL Insert DNA，滅菌1.0μL ddH2O；向上管中加5.0μL Ligation solutionⅠ（用前于冰上融化），16℃過夜。

1.2.6 PCR產(chǎn)物克隆及轉(zhuǎn)化 將上述純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接。采用含有16μL的XGal、4μL的IPTG和16μL 100mg/m L的Amp的LB平板篩選陽性克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒[16-22]。

1.2.7 鑒定目的基因 采用PCR以及酶切實(shí)驗(yàn)這兩種方法驗(yàn)證目的基因。用HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切體系的總體積20.00μL，其成分為：質(zhì)粒，8.00μL；Buffer M（1.0mmol/L），2.00μL；HindⅢ，1.00μL；滅菌ddH2O，9.00μL。將混合反應(yīng)物置于37℃下，反應(yīng)3h左右。加入0.5mol/L EDTA終止反應(yīng)，電泳觀察。

PCR鑒定目的片段的反應(yīng)體系總體積為25.00μL，其主要成分：模板，1.00μL；10×Buffer，5.00μL；dNTP，8.00μL；正鏈引物，2.00μL；反鏈引物，2.00μL；Taq DNA聚合酶，1.00μL；滅菌ddH2O，6.00μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性處理1m in；94℃變性30s，50℃退火40s，72℃延伸90s，循環(huán)次數(shù)30次；最后72℃延伸7m in，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 目的基因測序及序列分析 將經(jīng)酶切鑒定的帶有目的基因片段的重組菌株進(jìn)行測序，由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。將所克隆基因序列的測序結(jié)果與GenBank上的相應(yīng)序列進(jìn)行BLAST比較分析，比對(duì)分析其核苷酸序列和編碼的氨基酸序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠色木霉總RNA的提取結(jié)果

真菌細(xì)胞RNA中以rRNA含量最為豐富，由28S、18S和5S組成。本實(shí)驗(yàn)采用改良的Trizol法提取綠色木霉的基因組RNA，瓊脂糖電泳結(jié)果圖1顯示出基因組RNA的28S、18S、5S片段情況，28SRNA和18S RNA條帶清晰，無拖尾，5S部分降解較少。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，RNA樣品的OD260/OD280均值為1.964，說明抽提的總RNA完整性較好，純度高，雖然有少量被降解的跡象，仍然能夠滿足后續(xù)RT-PCR的要求。

圖1 綠色木霉的總RNAFig.1 Total RNA of Trichoderma viride

2.2 PCR擴(kuò)增目的基因

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用β-葡萄糖苷酶基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過電泳圖2結(jié)果分析，可以擴(kuò)增出約1.5kbp的目的大小片斷。用PCR回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與載體PMD-18連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞[23-24]。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增bglFig.2 RT-PCR amplification of bgl

2.3 質(zhì)粒的提取

挑取轉(zhuǎn)化平板上的菌落，采用堿法提取少量質(zhì)粒DNA，如電泳圖3所示。通過瓊脂糖凝膠電泳可以初步檢查質(zhì)粒的大小及濃度，其中提取的質(zhì)粒為三條帶，超螺旋帶最亮，說明質(zhì)粒提取質(zhì)量較好。

圖3 質(zhì)粒電泳圖Fig.3 Electrophoresis picture of the plasmid

2.4 重組克隆載體的鑒定結(jié)果

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選取質(zhì)粒用HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，1、2泳道僅有約2.5kbp大小的片斷，是未與目的片斷連接的載體電泳結(jié)果；3泳道顯示有大約4.0、2.5kbp的片斷，質(zhì)粒載體與目的基因片斷之和約為4.0kbp，目的片斷約為1.5kbp，證實(shí)其已克隆至載體上。應(yīng)用特異引物，以提取的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。由圖5中2泳道所示，PCR反應(yīng)可以獲得1.5kbp的目的片斷，進(jìn)一步證實(shí)目的片斷已克隆到載體上。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，pMD18-T-bgl能夠得到與目的片段大小相符的特異性條帶，條帶與載體及目的片段大小相對(duì)應(yīng)，表明bgl已經(jīng)成功克隆至載體上。

圖4 限制性內(nèi)切酶鑒定目的片斷Fig.4 Identification of the objective fragments by digestion endonucleas

圖5 PCR鑒定目的片斷Fig.5 Identification of the objective fragments by PCR

2.5 基因序列測定及分析

所測β-葡萄糖苷酶基因序列共1532bp，將所克隆基因序列的測序結(jié)果與GenBank上的綠色木霉相應(yīng)序列進(jìn)行BLAST比較分析，該序列中僅有幾處發(fā)生堿基缺失，同源性達(dá)到98.8%。不同菌株中的β-葡萄糖苷酶基因有所差別，這說明不同菌株的β-葡萄糖苷酶基因變異是普遍的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以綠色木霉（Trichoderma viride）的總RNA為模板，首先根據(jù)GenBank上檢索的β-葡萄糖苷酶基因（bglⅠ）DNA序列，設(shè)計(jì)出特異性引物。然后運(yùn)用PT-PCR進(jìn)行了擴(kuò)增bglⅠ片段，并將其連接到pMD18-T載體，并成功轉(zhuǎn)化到E.coli JM 109測序。實(shí)驗(yàn)所獲得的綠色木霉β-葡萄糖苷酶基因bgl全長為1532bp，與GenBank上檢索的β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列相比，其DNA序列同源性可達(dá)到98.8%。

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