脫脂米抗氧化肽的分離純化與研究

徐亞元，周裔彬，萬(wàn) 苗，金 鑫

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽省食品安全分析與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

功能活性肽因其具有高活性、易吸收、健康安全等特點(diǎn)已成為食品領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，而從植物蛋白中提取活性肽更受人們青睞，其中抗氧化肽是最為熱門(mén)的課題之一[1-2]。米糠蛋白的效價(jià)比高，一般為2～2.5，其消化率高達(dá)90%[3]，同時(shí)它具有低過(guò)敏性，是已知谷物中過(guò)敏性最低的蛋白[4-5]。抗氧化肽是指一類(lèi)具有抑制生物大分子過(guò)氧化或清除體內(nèi)自由基功效的生物活性肽[6]，含有2～50個(gè)氨基酸殘基不等[7]。米糠蛋白水解物中含有豐富的供氫體，可以清除自由基，終止自由基反應(yīng)鏈，從而起到抑制和清除自由基的能力，達(dá)到抗衰老的功能[8]。通過(guò)酶解技術(shù)水解米糠蛋白能得到可溶性寡肽，而且具有特殊的生理功能，可以作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和功能因子，可以影響或改善人們的營(yíng)養(yǎng)代謝、脂肪代謝、糖代謝、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等[9-10]。梅德軍等[11]用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解制備米糠蛋白抗氧化肽。付巖松等[12]研究表明了米糠抗氧化肽對(duì)D-半乳糖致衰小鼠的線(xiàn)粒體具有保護(hù)作用。Zhou mei等[13]通過(guò)酶水解法制得的米糠抗氧化肽的水解度為23.67%，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)64.26%。關(guān)于米糠抗氧化肽的分離、純化、鑒定也有一定的研究，如Mei De jun等[14]研究得到M r＜3ku的米糠抗氧化肽具有最好的DPPH自由基清除力。

由于脫脂米糠目前主要作為動(dòng)物飼料，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值未能被充分開(kāi)發(fā)利用，關(guān)于其抗氧化肽也鮮有報(bào)道，因此本文探討了脫脂米糠抗氧化肽的分離純化的方法及其氨基酸含量的測(cè)定與分子分布，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂米糠 安徽金潤(rùn)米業(yè)有限公司；分子量標(biāo)準(zhǔn)品（BSA、核糖核酸酶A、Vitamin B12、尿嘧啶、氨基乙酸） 賽分公司；離子交換劑DEAE-52纖維素、葡聚糖凝膠Sephadex G-15 Pharmacia公司；堿性蛋白酶 Sigma公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Waters 600高效液相色譜 美國(guó)Waters公司；氨基酸自動(dòng)分析儀 美國(guó)安捷倫1100；BioLogic LP層析系 Bio-Rad Laboratories Inc。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠蛋白的制備工藝流程 稱(chēng)取10g脫脂米糠與pH13的NaOH溶液按1∶10的比例混合，在35℃下提取3h，離心得到的米糠沉淀冷凍干燥后與pH 0.5的HCl溶液按1∶8的比例混合，在40℃下提取3.5h，離心得到的米糠沉淀冷凍干燥后與0.6mol/L的NaCl溶液按1∶10的比例混合，在45℃下提取2.5h，離心保留上清液，并與前兩步所得的上清液合并，經(jīng)等電點(diǎn)沉淀（pH4.5）、離心后所得到的沉淀即為脫脂米糠蛋白。

1.2.2 脫脂米糠抗氧化肽的制備工藝流程 將上述所制備的脫脂米糠蛋白粉粉碎過(guò)80目篩后，用緩沖液將其配制成pH為9，濃度為5%（w/v）米糠蛋白懸浮液，在25℃恒溫水浴溶解30m in，然后加入堿性蛋白酶并調(diào)節(jié)酶與底物濃度比（[E]/[S]）為1.8%，通過(guò)pH-stat法使體系pH穩(wěn)定為9，在溫度為50℃的條件下酶解4.6h，然后100℃加熱10m in滅酶。

1.2.3 離子交換層析分離米糠抗氧化肽 本實(shí)驗(yàn)選用DEAE-52作為離子交換層析介質(zhì)，將處理后的DEAE-52纖維素用0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）平衡后裝柱（26mm×20cm），選用pH 6.8、0.02mol/L磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液（A相），0.6mol/L的NaCl溶液為B相。洗脫程序?yàn)椋?～45min A；45～90min 30%B；95～140m in 70%B；140～215m in 100%B；215～230m in A。將DRBAP配制成5mg/m L的溶液，上樣量為4m L，在LP層析系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.5m L/min，280nm處檢測(cè)，收集各洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥各級(jí)洗脫組分，以捕獲DPPH自由基能力為檢測(cè)指標(biāo)篩選抗氧化活性最高的DRBAP作為下一步分離對(duì)象。

1.2.4 凝膠層析分離米糠抗氧化肽 將葡聚糖凝膠SephadexG-15處理好裝成1cm×50cm的層析柱，對(duì)經(jīng)離子交換層析分離后所得活性最高的組分進(jìn)行分離，用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.1m L/m in，280nm處檢測(cè)，收集各洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥各級(jí)洗脫組分，以捕獲DPPH自由基能力為檢測(cè)指標(biāo)篩選抗氧化活性最高的DRBAP作為下一步研究對(duì)象。

1.2.5 純化后DRBAP抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 亞油酸體系中抗氧化能力的檢測(cè) 采用硫氰酸鐵法，按Tepe[15]和Osawa[16]的方法稍加修改。稱(chēng)取10mg RBPHs溶于10m L 50mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，加入10m L的無(wú)水乙醇和65μL亞油酸，再用蒸餾水調(diào)整到25m L，在混勻器上混合均勻，用硅橡膠塞密封，放在60℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫，每隔24h測(cè)定吸光度。吸光度的測(cè)定：取反應(yīng)液0.1m L，依次加入4.7m L 75%的乙醇溶液，0.1m L 30%硫氰酸銨溶液和0.1m L 0.02mol/L硫酸亞鐵溶液（含3.5%HCl），混合均勻5m in后在500nm處測(cè)定吸光度（A樣），每天測(cè)定一次吸光度，以不添加RBPHs的為空白對(duì)照（A對(duì)照），所有吸光值均平行測(cè)定三次，取平均值，吸光值越高，表示抗氧化能力越低。

1.2.5.2 二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）清除能力的測(cè)定 采用Shimada等[17]的方法并稍加修改。將RBPHs配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/m L溶液，取2m L樣品溶液加入2m L 0.1mmol/L DPPH自由基的95%乙醇溶液，振蕩搖勻后，室溫下靜置60m in，于517nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)樣，同時(shí)以95%乙醇為空白對(duì)照，吸光值記為A空白，均平行測(cè)定三次，取平均值，DPPH·清除率計(jì)算公式為：

1.2.5.3 羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定 采用鄰二氮菲法測(cè)定[18]。

1.2.5.4 超養(yǎng)陰離子（O2-·）清除能力的測(cè)定 參考李艷紅[6]和汪建斌等[19]的方法。

1.2.5.5 螯合金屬離子能力的測(cè)定 參考Dinis TCP等[20]的方法。

1.2.6 抗氧化肽純度的鑒定 采用硅膠G薄層層析法：用硅膠GF254制備薄層層析板（20cm×10cm×0.2cm），以正丁醇∶冰醋酸∶水（4∶1∶1）作展層劑，點(diǎn)樣量15μL，最后用0.5%茚三酮丙酮溶液顯色[21]。

1.2.7 氨基酸的分析 參考王文平的方法[22]，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析。

1.2.8 HPLC測(cè)定DRBPHs的分子量分布 高效液相色譜：Waters；色譜柱：Sepax SRT-150，Sepax Zenix-150（5μm，300mm×7.8mm）；流動(dòng)相：150mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）；檢測(cè)：UV210nm；流速：1m L/m in；柱溫：25℃。分子量標(biāo)準(zhǔn)品為：BSA（M r 6600）、核糖核酸酶A（M r 13700）、Vitam in B12（M r 1355）、尿嘧啶（M r112）、氨基乙酸（Mr 75）。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換層析分離DRBAP

圖1 DEAE-52分離DRBAP的色譜圖Fig.1 Elution profileofDRBAP fractionsseparated by DEAE-52

離子交換層析主要是根據(jù)離子交換劑對(duì)各種離子或離子化合物的結(jié)合力的差異把不同的物質(zhì)分開(kāi)[23]，在此條件下，DRBAP得到了較好的分離，混合肽被分離出了10個(gè)組分，結(jié)果如圖1所示，從該圖可以看出，隨著NaCl溶液濃度的增加，分離效果越明顯。分別收集10個(gè)組分，分別命名為F1、F2……F10對(duì)其進(jìn)行DPPH自由基的清除率的測(cè)定，所得結(jié)果如圖2所示，所有組分中，F(xiàn)6對(duì)DPPH·的清除能力最強(qiáng)，清除率為71.24%，較純化前的DRBAP提高了近14%。重復(fù)分離收集組分F6，真空濃縮、冷凍干燥后，進(jìn)行下一步的分離。

圖2 各組分對(duì)DPPH·的清除能力（1mg/mL）Fig.2 DPPH free radical Scavenging activity of different fractions（1mg/mL）

2.2 凝膠色譜分離組分F6

凝膠色譜分離樣品是根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離的，分子量大的先被洗脫出來(lái)，分子量小的，后出來(lái)。上樣時(shí)，一般應(yīng)盡可能地使用高濃度的樣品，但又不影響分辨率[24]，因?yàn)闃悠窛舛冗^(guò)高，粘度增加，降低層析的分辨率；而且上樣體積越小，凝膠色譜分離樣品的分辨效果越好[25]。因此，為了保證較好的分離效果，本研究中選用葡聚糖凝膠Sephadex G-15，經(jīng)條件摸索，確定分離組分6時(shí)選用進(jìn)樣濃度約為10mg/m L，進(jìn)樣體積為800μL。

圖3 Sephadex G-15分離F6的色譜圖Fig.3 Elution profile of F6 fractions separated by Sephadex G-15

圖4 各組分對(duì)DPPH·的清除能力（1mg/mL）Fig.4 DPPH free radical Scavenging activity of different fractions（1mg/mL）

分離結(jié)果如圖3所示，F(xiàn)6組分經(jīng)過(guò)凝膠色譜分離后得到5個(gè)組分，按分子由大到小命名為G1、G2……G5，重復(fù)分離收集個(gè)組分，真空濃縮、冷凍干燥后，測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的清除力，結(jié)果如圖4所示。

由圖4知，不同組分對(duì)DPPH·清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篏1＜G2＜G3＜G5＜G4，組分G4活性最強(qiáng)，清除率達(dá)78.67%?？寡趸牡幕钚耘c其分子量的大小密切相關(guān)，而本研究也證明了這點(diǎn)。隨著分子的逐漸減小，組分的活性逐漸增強(qiáng)，其中，G5分子量最小，但活性卻呈減弱趨勢(shì)，這有可能是因?yàn)槔锩婧幸恍┎痪哂谢钚缘挠邪被?。這現(xiàn)象與其他一些研究者的報(bào)道是相吻合的，如Wang等[26]分離小麥面筋蛋白酶解物組分P，Sun等[27]報(bào)道的蘑菇肽以及李艷紅[7]凝膠色譜分離鷹嘴豆蛋白酶解物組分Fra.IV的抗氧化活性均與分子量大小有關(guān)系。

2.3 G4抗氧化活性的測(cè)定

圖5 未純化的RBPHs與G4在亞油酸體系中的抗氧化作用（0.6mg/mL）Fig.5 Antioxidantactivities in linoleic acid system of unpurified RPBHs and G4（0.6mg/mL）

圖6 未純化的RBPHs與G4在亞油酸體系中的抗氧化作用（0.6mg/mL）Fig.6 Free radical scavenging and ferrous ion-chelating effect of unpurified DRBAP and G4（0.6mg/mL）

本實(shí)驗(yàn)研究了抗氧化肽G4的抗氧化活性，并與未純化的DRBAP進(jìn)行了比對(duì)，從圖5～圖6可以看出，經(jīng)離子交換層析和凝膠色譜層析后的組分G4在亞油酸體系中的抗氧化能力、自由基捕獲力以及金屬離子螯合率均有大幅提升。G4濃度為0.6mg/m L時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH、O·以及鐵離子螯合率分別為：78.67%、56.14%、36.45%、60.22%，G4對(duì)DPPH·的捕獲能力依舊最強(qiáng)，對(duì)·OH相對(duì)比較弱。其中，對(duì)DPPH·、·OH、O·清除率較純化前的DRBAP依次提高了20%、9%、16%，對(duì)鐵離子的螯合率提高了近11%，在亞油酸體系中吸光值下降了0.7，這些都說(shuō)明經(jīng)兩步分離純化后米糠抗氧化肽的活性得到提高，也證明了米糠蛋白中確實(shí)含有抗氧化活性肽。

2.4 G4純度的初步鑒定

從圖7結(jié)果可以看出，經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析和SephadexG-15柱層析純化后的脫脂米糠抗氧化肽G4，經(jīng)顯色劑顯色后為單一點(diǎn)，這可以說(shuō)明米糠抗氧化肽的雜質(zhì)組分已很少，基本可以推斷其得到了純化。

圖7 組分G4的薄層層析圖Fig.7 The thin-layer chromatogram of G4

2.5 G4氨基酸的分析

抗氧化肽的活性與氨基酸種類(lèi)和組成密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，一些單一的氨基酸也會(huì)具有某些抗氧化活性，如Lys、Tyr、Glu、Pro、Gly、Phe和His，但活性不如多肽活性高，且很多氨基酸不具有抗氧化活性，而當(dāng)它們組合在一起形成多肽時(shí)又具活性[28-29]，所以氨基酸的組合與排列順序?qū)Χ嚯牡目寡趸钚苑浅Ｖ匾?，這有可能是肽鏈內(nèi)的氨基酸之間的短程相互作用，增強(qiáng)了它們與自由基的作用[30]。

通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)G4氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，并與脫油米糠蛋白、未純化的DRBAP的氨基酸組成進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，米糠蛋白、DRBAP以及G4的氨基酸組成存在比較大的區(qū)別，經(jīng)純化后的G4含主要的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Phe、Arg、Pro，含量較米糠蛋白與DRBAP均有大幅提高，除了A rg其他氨基酸的側(cè)鏈均具有疏水性。Rajapakse等[31]研究表明，當(dāng)?shù)鞍姿馕镆约岸嚯闹械氖杷园被岷吭黾?，脂溶性?huì)提高從而增加其抗氧化活性。另外，謝正軍[32]分離純化酶解苜蓿蛋白酶解物得到的抗氧化活性肽為Glu-Tyr-Asp-Pro，李艷紅[6]分離出鷹嘴豆蛋白抗氧化肽為Asn-Arg-Tyr-H is-Glu，以及吳建中[33]報(bào)道的大豆蛋白抗氧化肽也含有這幾種主要氨基酸，均證明了抗氧化肽的活性與氨基酸的種類(lèi)與組成有關(guān)系。除了上述的幾種主要氨基酸，G4中其他氨基酸的含量基本都降低，不過(guò)賴(lài)氨酸的含量依舊達(dá)到7.54g/100g，這很好的彌補(bǔ)了賴(lài)氨酸是大米蛋白中的限制性氨基酸的缺陷。

表1 DRBAP和米糠蛋白的氨基酸組成的比較（g/100g蛋白質(zhì)）Table1 Comparative amino acid profile of DRBAP and rice bran protein isolates（g/100g protein）

2.6 組分G4與DRBAP的相對(duì)分子質(zhì)量分布

通過(guò)HPLC測(cè)定DRBAP和組分G4的相對(duì)分子得到的結(jié)果如表2所示，DRBAP相對(duì)分子質(zhì)量小于1000u的組分比例為77.85%，這說(shuō)明，DRBAP中2～9個(gè)氨基酸組成的小分子肽比例較大，這可能是其具有良好抗氧化性的原因所在。而DRBAP經(jīng)過(guò)離子交換層析和凝膠色譜純化后，相對(duì)分子質(zhì)量小于1000u的組分比例達(dá)到90.83%，其中，分子量小于500u的組分也達(dá)到14.38%，這說(shuō)明G4組分中2～4肽的含量也比較多。

3 結(jié)論

3.1 選用DEAE-52纖維素作為離子交換層析介質(zhì)，用NaCl對(duì)DRBAP進(jìn)行梯度洗脫，分離效果越明顯，得到了10個(gè)組分，其中第6個(gè)組分F6對(duì)DPPH·的清除能力最強(qiáng)，清除率為71.24%。然后，通過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex G-15對(duì)F6繼續(xù)分離得到了5個(gè)不同組分，它們對(duì)DPPH·清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篏1＜G2＜G3＜G5＜G4，組分G4活性最強(qiáng)，清除率達(dá)78.67%。通過(guò)薄層層析對(duì)G4純度初步鑒定，發(fā)現(xiàn)其經(jīng)顯色劑顯色后為單一點(diǎn)，說(shuō)明得到了較好的純化。

表2 DRBAP與G4的相對(duì)分子質(zhì)量分布（%）Table2 Molecularweight distribution of DRBAP and G4（%）

3.2 經(jīng)離子交換層析和凝膠色譜層析后的組分G4的體外抗氧化活性較未純化的DRBAP均有提升。對(duì)DPPH自由基、·OH、O·清除率較純化前的DRBAP依次提高了20%、9%、16%，對(duì)鐵離子的螯合率提高了近11%，在亞油酸體系中吸光值下降了0.7。

3.3 氨基酸組分析，得到G4的主要氨基酸成分為：Asp、Glu、Leu、Phe、Arg、Pro。組分G4的相對(duì)分子質(zhì)量小于1000的比例達(dá)到90.83%，分子量小于500的達(dá)到14.38%。

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