野菊花莖葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及其對(duì)植物病原真菌抑制作用

劉曉丹，劉存芳，賴普輝，趙赟愷，吝 敏，陳 凱

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

野菊花（Chrysanthemum indicum L.）是菊科菊屬的一種多年生草本植物[1]，俗稱山菊花、野黃菊花、甘菊花等，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，資源十分豐富，陜西南部盛產(chǎn)野菊花。中國(guó)藥典中記載野菊花有清熱解毒、平肝明目、降低血壓等功效。本草綱目中匯載，野菊花能治療癰腫、瘡毒等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，野菊花具有廣譜抗菌活性[2]，有保護(hù)心臟，降壓，解熱，抑制血小板聚集，增強(qiáng)免疫，抗病毒，抗腫瘤[3]，抗炎，清除氧自由基，保肝養(yǎng)肝等作用。近年來(lái)人們對(duì)野菊花中的化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，野菊花中含有多糖[4]、萜類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)[5]、蛋白質(zhì)和氨基酸、營(yíng)養(yǎng)元素[6]、揮發(fā)油[7]、維生素、色素等多種活性成分，通常人們的研究多集中在野菊花的頭狀花序中化學(xué)成分的分析測(cè)試和活性研究[7]，并利用多種提取溶劑對(duì)野菊花的頭狀花序中活性成分進(jìn)行提取和活性測(cè)試研究[8-10]，對(duì)野菊花揮發(fā)油成分及生物活性的研究報(bào)道也較多[7，11]，但對(duì)野菊花莖葉中揮發(fā)油開發(fā)和利用的研究報(bào)道較少。這里用普通的水蒸氣蒸餾法從秦巴山區(qū)野菊花的莖葉中提取揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)野菊花莖葉中的揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定，運(yùn)用峰面積歸一化法確定野菊花莖葉中的揮發(fā)油各個(gè)化學(xué)成分的相對(duì)百分含量，并對(duì)其揮發(fā)油進(jìn)行植物病原真菌的抗菌活性研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用秦巴山區(qū)野菊花植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野菊花全草 在2012年10月中旬收集于陜西省漢中市巴山山區(qū)，經(jīng)過陜西理工學(xué)院植物學(xué)科專家趙樺教授鑒定，認(rèn)定是菊科菊屬的野菊花（Chrysanthemum indicum L.）植物，取其莖葉，陰干粉碎，密封保存?zhèn)溆?；油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、煙草赤星病菌（Alternaria longipes）、核桃果炭疽病菌（Pathogenic bacteria）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea），5種供試細(xì)菌菌種 均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；無(wú)水硫酸鈉 AR，西安化學(xué)試劑廠；丙酮、氯化鈉 AR，開封化學(xué)試劑總廠；無(wú)水乙醚 AR，西安三浦化學(xué)試劑有限公司；水 為二次蒸餾水。

Agilent 7890A-5973N型GC-MS儀 美國(guó)安捷倫公司；DOB-20003型光電分析天平 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；FW 100型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；水蒸氣蒸餾裝置 天津化玻儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 野菊花莖葉揮發(fā)油的提取 稱取野菊花的莖葉粉末100g，用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油10h[12]，蒸餾出來(lái)的溶液用氯化鈉飽和后，用乙醚萃取三次，上層萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥過夜，低溫蒸餾回收乙醚，得到一種有特殊清香氣味的黃色油狀物1.63g，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，其揮發(fā)油的平均收率為1.63%，低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 野菊花莖葉揮發(fā)油的GC-MS分析 利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)對(duì)野菊花莖葉揮發(fā)油進(jìn)行分離和分析測(cè)定，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢索譜圖庫(kù)，確定所得野菊花莖葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)含量。

色譜條件：色譜柱型號(hào)：HP-5（30m×250μm×0.5μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣為99.999%的高純氦氣，柱溫：柱溫50℃，保持1m in后，再以8℃/m in的升溫至280℃，保持3min；進(jìn)樣口溫度為280℃，流速為1.0m L/m in，進(jìn)樣量0.2uL，分流比為10∶1。質(zhì)譜條件：EI離子源，電離能量70電子伏特，離子源溫度230℃，掃描范圍40～550質(zhì)量單位，掃描模式：全掃描。

1.2.3 野菊花莖葉揮發(fā)油抑制植物病原真菌的作用

采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定野菊花莖葉揮發(fā)油對(duì)5種供試病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。將野菊花莖葉揮發(fā)油用丙酮溶解，加入無(wú)菌水稀釋配制成所需濃度，在無(wú)菌條件下與PDA培養(yǎng)基混合制成含藥平板。設(shè)丙酮空白對(duì)照，每次處理重復(fù)3次。用鉆孔器打取直徑5mm的菌餅，菌絲面向下接種于含藥平板上，放入25～26℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。用十字交叉法分別于處理后36h測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑，根據(jù)式（1）和式（2）來(lái)計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 野菊花莖葉揮發(fā)油的成分分析

每一個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)過GC-MS聯(lián)用儀的計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索進(jìn)行定性，質(zhì)譜庫(kù)為NIST庫(kù)，版本為L(zhǎng)ibrary version 2.0，質(zhì)譜圖與其對(duì)應(yīng)圖譜的相似度（SI）均在85%以上。野菊花莖葉揮發(fā)油中的各個(gè)化學(xué)成分的相對(duì)含量依據(jù)總離子流圖由計(jì)算機(jī)采用峰面積歸一化法統(tǒng)計(jì)[13]。野菊花莖葉揮發(fā)油中的各個(gè)化學(xué)成分確定結(jié)果列于表1中。由表1可知，從野菊花莖葉揮發(fā)油中分離出48種譜峰，鑒定出的化學(xué)成分為32種，占揮發(fā)油總量的65.75%，主要是單萜類、倍半萜類化合物及其含氧衍生物，其中相對(duì)含量較高的成分有2-（亞-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯（17.93%），樟腦（11.40%），7，11-二甲基-3-亞甲基-1，6，10-十二碳三烯（9.44%），桉樹腦（5.64%），冰片（3.87%）等揮發(fā)性化合物。在文獻(xiàn)報(bào)道的野菊花揮發(fā)油成分中，最多確定出的化合物有54種[7]，最少的有18種[11]。野菊花的莖葉揮發(fā)油中的化學(xué)成分比野菊花的花序揮發(fā)油中的化學(xué)成分更為復(fù)雜多樣，成分種類差異也較大，雖均含有樟腦、冰片、松油醇、石竹烯氧化物[14]，但含量不同，其中在野菊花揮發(fā)油中石竹烯氧化物占25.196%，樟腦占1.75%，而在其莖葉揮發(fā)油中石竹烯氧化物只占到0.78%，樟腦占了11.40%。在野菊花的莖葉揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)了含量較高的2-（亞-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯，含量高達(dá)17.93%，這種化學(xué)成分在所有對(duì)野菊花揮發(fā)油中的研究報(bào)道中均沒有被發(fā)現(xiàn)，這說明野菊花的莖葉揮發(fā)油有一些特殊的活性成分，其揮發(fā)油會(huì)具有獨(dú)特的生物活性，這還有待進(jìn)一步研究和開發(fā)。

2.2 野菊花莖葉揮發(fā)油的抑菌活性

野菊花莖葉揮發(fā)油的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，不同濃度的野菊花莖葉揮發(fā)油對(duì)5種供試菌株均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，特別是野菊花莖葉揮發(fā)油對(duì)油菜菌核病菌的抑制效果明顯地要強(qiáng)于對(duì)蘋果炭疽病菌和核桃果炭疽病菌的抑制效果，野菊花的莖葉揮發(fā)油對(duì)5種植物病原真菌的抑菌活性大小依次為：油菜菌核病菌＞蘋果炭疽病菌＞煙草赤星病菌＞番茄灰霉病菌＞核桃果炭疽病菌。實(shí)際上植物揮發(fā)油呈現(xiàn)出多種獨(dú)特的生物活性，如有抗氧化活性可清除羥基自由基、消炎、理氣、止痛、滅菌、清熱解毒等[12]，一些已用于保健、衛(wèi)生、醫(yī)療和食品工業(yè)[13]，開發(fā)野菊花莖葉揮發(fā)油有廣闊的前景。野菊花莖葉揮發(fā)油是一種具有抑菌活性的物質(zhì)，其主要抑菌成分及含量還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

從秦巴山區(qū)野菊花的莖葉中提取揮發(fā)油，用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分離和鑒定出了32種化學(xué)成分，其主要是單萜類、倍半萜類化合物及其含氧衍生物，和文獻(xiàn)報(bào)道的野菊花揮發(fā)油中的成分相比較[7，11]，成分種類差異較大，但是一些主要成分是一致的[14]。在野菊花的莖葉揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)了含量較高的成分：2-（亞-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯（2-（hexa-2，4-diyn-1-ylidene）-1，6-dioxas-piro[4，4] non-3-ene），其含量高達(dá)17.93%。野菊花的莖葉揮發(fā)油在測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)5種供試菌株均有明顯的抑制作用，抑菌活性大小依次為油菜菌核病菌＞蘋果炭疽病菌＞煙草赤星病菌＞番茄灰霉病菌＞核桃果炭疽病菌，對(duì)油菜菌核病菌的抑菌作用相對(duì)最為顯著。這里也僅是對(duì)野菊花的莖葉揮發(fā)油的抗菌活性做了初步的研究，由于野菊花的莖葉揮發(fā)油化學(xué)成分種類的復(fù)雜多樣性，其抗植物病原真菌的活性機(jī)理和其他生物活性實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步研究。

表1 野菊花莖葉中揮發(fā)油組分分析Table1 Chrysantheinum indicum L.volatile oil from leaves and stems of componentanalysis

表2 野菊花的莖葉揮發(fā)油對(duì)5種植物病原真菌的抑菌活性Table2 Chrysantheinum indicum L.leaf volatile oil of five kinds of antibacterial activity of plant pathogenic fungi

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