環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌

董鑫悅，滿朝新，盧 雁，郭 穎，王今雨，楊相宜，郎 友，龐心怡，姜毓君，，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150086; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是一種革蘭氏陰性、無(wú)芽孢的兼性厭氧細(xì)菌［1］。它能導(dǎo)致任何年齡層人群的疾病，尤其是對(duì)早產(chǎn)兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，能引起新生兒敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎［2］。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)以及需要復(fù)雜昂貴的儀器［3］。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法一直是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)由Notom i等于2000年建立，該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下(60～65℃)高效(0.5～1.0h)擴(kuò)增目標(biāo)DNA，具有很高的特異性和靈敏度，快速簡(jiǎn)便，擴(kuò)增產(chǎn)物量大，肉眼、電泳、濁度儀或肉眼均可進(jìn)行檢測(cè)［4－5］。本研究擬利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)乳中的阪崎腸桿菌，建立一種快速檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌的方法，為這一方法的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎腸桿菌(ATCC29544、ATCC51329)、金黃色葡萄球菌(ATCC13565、CMCC26074、CMCC26075、CMCC26112)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC50222)、亞利桑那沙門氏菌(CMCC47020)、都柏林沙門氏菌(CMCC50042)、湯卜遜沙門氏菌(CMCC50120)、單增李斯特菌(CMCC54004、CMCC54006、CMCC54002)

中國(guó)食品藥品檢定研究院;大腸桿菌(ATCC25922)、大腸桿菌 O1、英諾克李斯特菌(ATCC33090)、銅綠假單胞桿菌(ATCC27853)、蠟樣芽孢桿菌 (CMCC63303)、福氏志賀氏菌(CMCC51572) 福建省疾病預(yù)防控制中心;阪崎腸桿菌(BQ－1、BQ－2)、大腸桿菌O157:H7、藤黃微球菌(ATCC4698) 實(shí)驗(yàn)室保存Bst大片段DNA聚合酶 New England Biolab;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)有限公司;甜菜堿(Betaine) 美國(guó)Sigma公司;DNA提取液(0.1mol/L Tris－Hcl、0.1mol/L EDTA、0.1mol/L Na3PO4、1.5mol/L NaCl、1%CTAB，溶解后調(diào)節(jié)pH8.0，室溫保存);9700型PCR儀 美國(guó)ABI公司;UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司;引物序列由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)以及DNA模板的制備 阪崎腸桿菌ATCC29544及23株其他菌株培養(yǎng)于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA，溶于無(wú)菌水中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 選取Genbank中阪崎腸桿菌 OmpA 基 因 序 列［6］(Accession number: DQ000206)，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一套特異性引物，包括B3，F(xiàn)3，F(xiàn)IP，BIP，LF，LB。引物序列:B3－GATTCGCCCATACCACGAT;

1.2.3 LAMP反應(yīng)的體系優(yōu)化與確立

1.2.3.1 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化 參考文獻(xiàn)［7－9］，選擇不同濃度比例的外引物和內(nèi)引物(1∶4～1∶9)、不同濃度比例的外引物和環(huán)引物(1∶1～1∶5)、不同濃度梯度的MgCl2(0～6mmol/L)、不同濃度梯度的dNTPs (0.4～2.4mmol/L)、不同添加量的Bst DNA聚合酶(0.5～1.0μL)進(jìn)行LAMP反應(yīng)，電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)是否形成典型的梯狀條帶以及條帶的亮暗來(lái)確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.3.2 LAMP反應(yīng)體系 配制25μL反應(yīng)體系，分別將一定量的內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物、MgCl2、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、甜菜堿、Bst DNA聚合酶大片段、10×Buffer、DNA模板混勻，用滅菌水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件:95℃5m in，迅速冷卻加入酶，64℃保持40m in，80℃保持2min反應(yīng)結(jié)束。

1.2.4 LAMP檢測(cè)阪崎腸桿菌的靈敏度和特異性 將計(jì)好數(shù)的阪崎腸桿菌液進(jìn)行十倍梯度稀釋，取各稀釋度菌液1m L，提取其DNA，取2μL作為模板進(jìn)行PCR和LAMP反應(yīng)。

用建立的LAMP方法分別對(duì)上述所列4株阪崎腸桿菌和19株非阪崎腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，電泳觀察結(jié)果，驗(yàn)證LAMP方法特異性。

1.2.5 LAMP檢測(cè)人工污染乳中阪崎腸桿菌

1.2.5.1 人工污染乳中阪崎腸桿菌基因組DNA的提取方法比較 試劑盒法(細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒)按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行DNA提取;熱裂解法:人工污染的滅菌乳中分別加入1m L無(wú)水乙醇、1m L氯仿、1m L氨水混勻。12000 r/m in離心10min棄上清。加入200μL滅菌水混勻后，10000 r/m in離心1m in，棄上清。加入100μL滅菌水混勻，于沸水浴中煮沸10m in，10000r/min離心1m in，取上清－20℃?zhèn)溆?蛋白酶K法:1m L樣品中分別加入1m L DNA提取液、10μL溶菌酶、10μL蛋白酶K混勻后，37℃ 200 r/m in振蕩孵育1.5h。加入50μL的20%SDS，65℃孵育20m in。然后，12000r/min離心1min，取上清。在得到的上清液中加入1m L的異丙醇，混勻后加入吸附柱AC中10000 r/min離心30s，去上清。所得的沉淀用預(yù)冷的70%乙醇重復(fù)洗滌和干燥三次。最后加入50μL的TE緩沖液溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 人工污染乳的檢出限 從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買的液體乳經(jīng)過(guò)滅菌后，人為添加不同稀釋度的阪崎腸桿菌于乳中。分別提取各個(gè)稀釋度人工污染乳中阪崎腸桿菌的DNA，取2μL作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP檢測(cè)方法的建立

對(duì)阪崎腸桿菌ATCC29544的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼可見渾濁，瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)典型的梯形條帶。

圖1 阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LAMP檢測(cè)結(jié)果Fig.1 LAMP detection of Enterobacter sakazakii

2.2 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

通過(guò)上述優(yōu)化方法，最終確定LAMP的反應(yīng)體系為:0.2μmol/L外引物，1.6μmol/L內(nèi)引物，0.6μmol/L環(huán)引物，2mmol/L MgCl2，2mmol/L dNTPs，1μL的Bst DNA聚合酶(8U)，10×Buffer及2μL模板。在此反應(yīng)體系下，得到最佳的擴(kuò)增效果，保證了結(jié)果的穩(wěn)定性和特異性。

2.3 LAMP檢測(cè)純培養(yǎng)物的靈敏度

經(jīng)平板計(jì)數(shù)，原始菌液濃度為3.7×109cfu/m L。從圖2可見，泳道2～10都有LAMP擴(kuò)增條帶，而11、 12未見LAMP擴(kuò)增。由此可見，本研究建立的LAMP方法對(duì)阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的檢出限為 3.7×101cfu/m L。

圖2 LAMP檢測(cè)阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度電泳圖Fig.2 The sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii

由圖3可見，泳道2～9都有PCR擴(kuò)增條帶，而10、11未見PCR擴(kuò)增條帶。由此可見，PCR檢測(cè)阪崎腸桿菌的靈敏度為3.7×102cfu/m L。本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法靈敏度是PCR方法的10倍。

圖3 PCR檢測(cè)阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度電泳圖Fig.3 The sensitivity of PCR reaction for Enterobacter sakazakii

2.4 LAMP特異性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明，兩株阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株以及兩株阪崎腸桿菌野株均呈陽(yáng)性反應(yīng)。其他19株非阪崎腸桿菌均呈陰性反應(yīng)，未出現(xiàn)梯形條帶。

2.5 人工污染乳中阪崎腸桿菌DNA的提取

分別采用試劑盒法、熱裂解法以及手提DNA法提取人工污染乳中的阪崎腸桿菌DNA，LAMP擴(kuò)增結(jié)果都有典型的梯形條帶，且差異不大。熱裂解法操作簡(jiǎn)單，而且能節(jié)省很多時(shí)間，所以選取了熱裂解法提取乳中DNA。

2.6 人工污染乳中LAMP的檢測(cè)限

人工污染乳的阪崎腸桿菌的濃度從4.3×108～4.3×10－1cfu/m L，分別提取DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖6所示。泳道2～9均有LAMP擴(kuò)增條帶，而10、11泳道未見擴(kuò)增條帶。由此可見，LAMP檢測(cè)人工污染乳中阪崎腸桿菌的檢測(cè)限為4.3×101cfu/m L。

圖4 LAMP特異性實(shí)驗(yàn)電泳圖Fig.4 The specificity of LAMP reaction

圖5 三種不同方法提取乳中DNA的LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Three differentmethods of DNA extraction

圖6 LAMP檢測(cè)人工污染乳中阪崎腸桿的靈敏度電泳圖Fig.6 The sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii inmilk

3 結(jié)論

3.1 目前，阪崎腸桿菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要是PCR方法和熒光定量PCR法［10］。而LAMP方法應(yīng)用到液體乳中的研究相對(duì)較少，本研究進(jìn)行了LAMP檢測(cè)液體乳中阪崎腸桿菌的初步探索。本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌的LAMP方法，操作簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的儀器，反應(yīng)過(guò)程只需水浴鍋即可［11］;LAMP引物的設(shè)計(jì)是針對(duì)6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的，特異性強(qiáng)［12］，根據(jù)特異性實(shí)驗(yàn)同樣證明的這一點(diǎn);靈敏度高［13］，本實(shí)驗(yàn)建立的方法靈敏度比普通的PCR方法靈敏度高10倍左右;由于添加了環(huán)引物，使得LAMP反應(yīng)時(shí)間大大減少。并且對(duì)于樣品處理方法進(jìn)行了選擇優(yōu)化，縮短了模板制備的時(shí)間，使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程能在2h內(nèi)完成。

3.2 在LAMP方法中，設(shè)計(jì)出靈敏度高、特異性強(qiáng)的LAMP引物是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)之一。在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，注意Tm值的設(shè)置、GC含量、引物末端穩(wěn)定性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等問(wèn)題［14］。本研究所建立的LAMP檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌方法有很多地方需要進(jìn)一步探索和完善［15］，例如結(jié)果鑒定的手段較為單一，主要依靠瓊脂糖凝膠電泳，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。而現(xiàn)有結(jié)果鑒定方法中，熒光染料法方便快捷，靈敏度較高。濁度檢測(cè)法則通過(guò)是否產(chǎn)生白色沉淀來(lái)判定是否進(jìn)行LAMP反應(yīng)［16］。所以，在以后的研究中可以對(duì)結(jié)果判定方面進(jìn)行不同的探索。

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