仔豬潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立

■陳 星 王清靜 王 蕾 朱惠玲 丁斌鷹 侯永清

（動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室武漢輕工大學(xué)，湖北武漢 430023）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種主要累及結(jié)腸黏膜層和黏膜下層的非特異性炎癥。建立合適的動(dòng)物模型是研究UC發(fā)病機(jī)制和治療手段不可缺少的重要方法。化學(xué)誘導(dǎo)性結(jié)腸炎是比較廣泛使用的UC模型，常用誘導(dǎo)介質(zhì)有葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate soduium，DSS）、惡唑酮（oxazolone）、角叉菜膠、2，4，6-三硝基苯磺酸（Trinitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS）和乙酸等。

TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎目前已成為國(guó)際上較為理想的炎癥性腸病模型，此法可在大鼠、小鼠上成功誘導(dǎo)結(jié)腸炎。乙酸模型是上世紀(jì)70年代在胃與十二指腸潰瘍模型基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的UC模型，能夠在大鼠、家鼠、家兔和豚鼠等動(dòng)物上誘導(dǎo)產(chǎn)生急性彌散性UC。Khan等（1997）研究發(fā)現(xiàn)乙酸模型中結(jié)腸IL-1β mRNA表達(dá)增加，LTB4（白三烯B4）、PGE2（前列腺素E2）、TXB2（血栓素B2）在乙酸處理組均比正常對(duì)照組高，其中LTB4水平高達(dá)50倍，這些病理變化與人類(lèi)UC在炎癥介質(zhì)方面非常相似。

目前UC模型動(dòng)物以鼠為主，鮮有仔豬的潰瘍性結(jié)腸炎模型。我們擬在仔豬上建立一種簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好、穩(wěn)定的潰瘍性結(jié)腸炎模型?？紤]到DSS的高成本和惡唑酮（oxazolone）、角叉菜膠的動(dòng)物特異性，所以本試驗(yàn)選用TNBS和乙酸作為誘導(dǎo)介質(zhì)進(jìn)行建模探索。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

乙酸：純度≥99.5%，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；三硝基苯磺酸（TNBS）：5%水溶液 (w/v)，購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

取體重接近，健康的（35±3）日齡斷奶仔豬18頭，按表1隨機(jī)分成對(duì)照組、TNBS處理組和乙酸組。仔豬飼喂相同的玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，預(yù)飼期3 d后正式試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法

1.2.2 模型制作方法

參照Cetinkaya等(2006)用于大鼠的造模方法，各組仔豬灌注前36 h禁食不禁水，按30 mg/kg BW靜脈注射戊巴比妥鈉，麻醉15 min后開(kāi)始灌腸。將豬左側(cè)臥位，將肛管輕輕旋轉(zhuǎn)插入肛門(mén)約25 cm，檢查有無(wú)糞塊堵塞。如有糞便則要用肥皂水洗腸，直至洗凈，再按劑量灌注TNBS、乙酸或生理鹽水，灌完后將豬倒立1 min后，將豬放回欄內(nèi)，讓豬靜臥，隨后觀察并記錄結(jié)果。

1.3 樣品采集

在灌注3 d或7 d后，注射50 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，15 min后屠宰，迅速取出結(jié)腸，沿腸系膜緣剪開(kāi)腸腔，用生理鹽水沖洗內(nèi)容物，并用濾紙吸干，平鋪固定腸段，肉眼觀察形態(tài)改變。另取炎癥或潰瘍處結(jié)腸各取若干組織（10 mm×10 mm），4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，制作病理切片觀察損傷變化。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 仔豬狀態(tài)與糞便情況

灌腸后每天觀察仔豬精神狀態(tài)、采食量、糞便性狀及是否便血等情況。

1.4.2 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分

結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）的半定量標(biāo)準(zhǔn)參照Vilaseca等（1990）的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)加以調(diào)整，按表2所需評(píng)定指標(biāo)評(píng)分。

表2 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。肉眼觀察評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬狀態(tài)與糞便情況

對(duì)照組灌注生理鹽水后，精神、采食正常，未出現(xiàn)稀便與便血。TNBS組6頭仔豬灌注25 mg/kg與50 mg/kg TNBS后，精神正常，采食略下降，出現(xiàn)稀便，第2 d即恢復(fù)。乙酸組3頭仔豬灌注5%乙酸后，精神、采食正常，出現(xiàn)短暫稀便即恢復(fù)；6頭仔豬灌注10%乙酸后，倦怠懶動(dòng)，后背微弓，推測(cè)有腹痛感，采食下降，出現(xiàn)稀便與膿血便，血便中可見(jiàn)腸黏膜脫落，血便第2 d消失，但仍有稀便，第3 d恢復(fù)。

2.2 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分（見(jiàn)表3）

表3 肉眼觀察評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分

對(duì)照組仔豬灌注生理鹽水后，屠宰采集結(jié)腸可見(jiàn)腸外壁沒(méi)有粘連，腸壁內(nèi)表面沒(méi)有潰瘍，腸壁沒(méi)有水腫，病理切片可見(jiàn)結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞沒(méi)有浸潤(rùn)，無(wú)纖維化；TNBS組和5%乙酸組仔豬均只表現(xiàn)出腸外壁輕微粘連和輕微水腫，病理切片可見(jiàn)結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞輕度浸潤(rùn)，輕度纖維化；而10%乙酸組仔豬灌注后3 d，腸外壁嚴(yán)重粘連和水腫，均出現(xiàn)潰瘍，病理切片可見(jiàn)結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞重度浸潤(rùn)，重度纖維化，灌注后7 d有所恢復(fù)。

病理切片組織學(xué)形態(tài)見(jiàn)圖1。對(duì)照組結(jié)腸黏膜皺襞紋理清晰，未見(jiàn)潰瘍，上皮完整、連續(xù)，腺體排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)清楚，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）。TNBS處理組和5%乙酸處理組仔豬肉眼觀察，僅可見(jiàn)輕微腸壁外周粘連，個(gè)別出現(xiàn)輕微水腫，病理觀察僅可見(jiàn)輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）；而10%乙酸灌腸3 d屠宰的結(jié)腸腸壁外周粘連嚴(yán)重，1頭出現(xiàn)1處約2 cm潰瘍?cè)?，另兩頭出現(xiàn)1處約1 cm潰瘍?cè)睿▓D1C），黏膜上皮壞死溶解脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，有大量淋巴細(xì)胞，多形核細(xì)胞，漿細(xì)胞，毛細(xì)血管充血，腸腺間質(zhì)出血（圖1D）。10%乙酸灌腸7 d屠宰的結(jié)腸切片中，可見(jiàn)潰瘍?cè)蠲撀洌▓D1E），仍有毛細(xì)血管充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但對(duì)比灌腸后3 d已明顯減少，另有大量成纖維細(xì)胞增生（圖1F）。

由此可見(jiàn)，直腸灌注10%乙酸能成功誘導(dǎo)仔豬結(jié)腸炎。

3 討論

腸黏膜是機(jī)體與外界接觸的一道屏障，腸黏膜受損導(dǎo)致腸黏膜屏障功能破壞，引起腸道細(xì)菌移位和促炎性因子的大量釋放，從而加重原發(fā)疾病，甚至誘發(fā)多臟器器官功能紊亂。潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)和克隆恩病（Cmhn'S dis?ease，CD）同屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD），其病因可能涉及免疫、遺傳、環(huán)境等。目前報(bào)道的IBD誘導(dǎo)性動(dòng)物模型中，制模介質(zhì)有乙酸、TNBS（2、4、6-三硝基苯磺酸）、二硝基氯苯、惡唑酮、角叉菜膠、葡聚糖硫酸鈉等，有些因?yàn)橹颇７椒◤?fù)雜，造模介質(zhì)價(jià)格昂貴，或者模型與人IBD相差較遠(yuǎn)，已日漸淘汰。

TNBS模型主要制炎機(jī)制是乙醇作為有機(jī)溶劑可以溶解腸黏膜表面的黏液，破壞腸黏膜屏障，協(xié)助TNBS這種半抗原物質(zhì)滲入結(jié)腸組織與大分子組織蛋白結(jié)合，形成全抗原，引起腸壁一系列免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致結(jié)腸炎癥的發(fā)生，出現(xiàn)血便與潰瘍等典型結(jié)腸炎癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，此模型炎癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，MPO酶活性也呈相關(guān)性升高，各種炎癥介質(zhì)如 PGE2、TXB2、LTB4、6-keto-PGF、LTC4、PAF和IL也發(fā)生明顯的變化，與人類(lèi)IBD類(lèi)似。本研究中，采用直腸灌注25 mg/kg和50 mg/kg TNBS的50%乙醇溶液，均只出現(xiàn)短暫的稀便，病理切片觀察也只有輕微炎性癥狀，與正常對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明此造模方法效果不佳，可能是由于豬與鼠的品種差異或者腸道結(jié)構(gòu)功能差異，對(duì)TNBS不敏感，不能誘導(dǎo)抗原性炎癥。

乙酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型是一種典型的化學(xué)誘導(dǎo)性炎癥模型，采用乙酸化學(xué)性刺激劑造成腸黏膜化學(xué)性損傷，繼而產(chǎn)生炎性癥狀。Fabia等（1992）在大鼠上選用4%、6%和8%濃度的乙酸直腸灌注，作用時(shí)間分別為10、15、20、25、30 s，乙酸體積均為2 ml，發(fā)現(xiàn)4%濃度作用15 s為最佳造模方法?？紤]到豬腸道的高耐受性和代謝迅速的特點(diǎn)，我們選用5%和10%的10 ml的乙酸直腸灌注1 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%乙酸達(dá)不到造模效果，而10%乙酸灌注的6頭仔豬的糞便性狀、結(jié)腸形態(tài)、組織學(xué)觀察均呈現(xiàn)出明顯的炎癥癥狀，同時(shí)通過(guò)造模3 d與7 d后的組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，3 d后出現(xiàn)潰瘍?cè)?，并有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)，而7 d后可見(jiàn)潰瘍?cè)钜衙撀?，炎性?xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，大量成纖維細(xì)胞增生，說(shuō)明炎癥正在恢復(fù)中。通過(guò)以上試驗(yàn)摸索，我們初步建立了仔豬乙酸性結(jié)腸炎模型，該模型方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，個(gè)體差異小，這為研究豬和人類(lèi)結(jié)腸炎制炎機(jī)理和治療方法提供一種有效手段。

圖1 病理切片組織學(xué)形態(tài)

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，直腸灌注乙酸可誘導(dǎo)仔豬結(jié)腸炎，簡(jiǎn)便易行，成本低，重復(fù)性好，但該模型在仔豬上只是進(jìn)行了初步摸索，其炎癥周期和制炎機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

（參考文獻(xiàn)11篇，刊略，需者可函索）