定性測定羊飼料中黃曲霉毒素總量殘留的高靈敏度檢測卡的研制

■ 武玉香 沈志強(qiáng)， 唐士云

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

黃曲霉毒素屬于結(jié)構(gòu)相似的黃曲霉毒素類化合物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。當(dāng)微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生致肝癌甚至死亡。GB17480—2008指出了飼料中黃曲霉毒素B1的測定——酶聯(lián)免疫法。NY/T 2071—2011指出了飼料中黃曲霉毒素B1的液相色譜-質(zhì)譜法檢測，這兩種方法均需要在實(shí)驗(yàn)室條件下操作，后者對樣本的前處理要求嚴(yán)格，步驟繁瑣，耗時長，需要的檢測費(fèi)用高。本研究的定性測定羊飼料中黃曲霉毒素總量殘留的高靈敏度檢測卡，可快速準(zhǔn)確地應(yīng)用于羊飼料中黃曲霉毒素總量殘留的定性檢測，為羊場快速準(zhǔn)確地測定羊飼料中黃曲霉毒素總量殘留提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AE99硝酸纖維素膜（Whatman公司生產(chǎn)）；SB06玻璃纖維膜、BL-1吸水紙、PVC底板（上海金標(biāo)生物科技公司生產(chǎn)）；黃曲霉毒素總量全抗原(山東綠都生物科技有限公司生產(chǎn))；黃曲霉毒素總量單克隆抗體（山東綠都生物科技有限公司生產(chǎn)）；羊抗鼠抗體（美國Jackson公司生產(chǎn)）；氯金酸，分析純（國藥集團(tuán)生產(chǎn)）。

1.2 儀器與設(shè)備

MULTISKAN MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；QL-866振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；JE1002型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）。UV1100紫外可見分光光度計(北京普析通用)；85-2恒溫磁力加熱攪拌器(上海志威電器有限公司)；CT14RD高速冷凍離心機(jī)(德國BECKMAN公司)；HGS201 切條機(jī)、ZX1000 bio-dot劃膜平臺(美國bio-dot公司)。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備及鑒定

一般認(rèn)為粒徑為20 nm的膠體金是最適合單克隆抗體的快速測試[1-3]。量取99 ml的超純水裝入250 ml的圓底燒瓶，放入攪拌子，置于磁力攪拌器上，加入1%氯金酸溶液1 ml，100 r/min速度攪拌，打開加熱開關(guān)，待溶液沸騰后迅速一次性加入1.6 ml檸檬酸三鈉溶液，氯金酸溶液由灰色逐漸變?yōu)榫萍t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱10 min，待溶液冷卻后，用微孔濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗體的標(biāo)記及金標(biāo)墊的制備

1.3.2.1 抗體標(biāo)記蛋白濃度的確定

取5支試管，每個管中加入1 ml膠體金溶液，用K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至9.0，加入10 μl稀釋不同濃度（分別為0、10、20、30、40 μg/ml）的抗體蛋白，振搖30 min，每管加入10%NaCl溶液各100 μl，最后觀察顏色剛好穩(wěn)定趨于不變的紅色試管中蛋白添加量為最少蛋白穩(wěn)定量，在這個基礎(chǔ)上加20%為最適蛋白標(biāo)記量[7-10]。

1.3.2.2 金標(biāo)墊的制備

按照1.3.2.1節(jié)找出的合適蛋白濃度標(biāo)記抗體，12 000 r/min離心30 min，小心去除上清液，將流動性沉淀用0.01 M pH值7.4的PBS復(fù)溶至原體積的1/10，得到金標(biāo)抗體，然后將金標(biāo)抗體按照800 μl的量均勻浸鋪到30 cm長，6 mm寬的SB06玻璃纖維膜上，37℃烘干60 min，得到金標(biāo)墊，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測線和質(zhì)控線的確定

將黃曲霉毒素總量全抗原用0.01 M pH值7.4的PBS稀釋成5個濃度梯度，分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml，在AE99硝酸纖維素膜用劃膜儀劃線，作為檢測線；將羊抗鼠抗體用0.01 M pH值7.4的PBS稀釋成5個濃度梯度，分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml，在AE99硝酸纖維素膜用劃膜儀劃線，作為質(zhì)控線，37℃烘干20 min，得到預(yù)包被的硝酸纖維素膜，干燥保存?zhèn)溆?。根?jù)線條的顏色深淺確定合適的檢測線和質(zhì)控線濃度。

1.3.4 檢測卡的組裝

將SB06玻璃纖維膜裁剪成2 cm×30 cm的條子，作為樣品墊；將BL-1吸水紙裁剪成2 cm×30 cm的條子，作為吸水墊。然后將樣品墊、金標(biāo)墊、預(yù)包被的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼到PVC底板上進(jìn)行組裝，最后切割成4 mm寬的條子，放進(jìn)金標(biāo)卡殼中，壓緊為檢測卡，干燥保存。

1.3.5 檢測卡的最低檢測限確定

1.3.5.1 樣品處理方法

稱取(2±0.05)g粉碎樣本于50 ml離心管中;加入10 ml 20%甲醇水溶液，2 000 r/min振蕩提取1 min，4 000 r/min離心5 min;吸取上層溶液待檢。

1.3.5.2 檢測卡的最低檢測限確定

檢測限指某一分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測待測物質(zhì)的最小濃度或最小量。取檢測卡檢測陰性羊飼料、10 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)添加樣品、20 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)添加樣品、30 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)添加樣品、50 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)添加樣品、1 000 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)添加樣品、5 000 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)添加樣品各50份，確定檢測卡的最低檢測限。

1.3.6 檢測卡的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取3個批次各30條檢測卡置于37℃，測定時間為第7 d、第14 d、第28 d、第56 d、第77 d、第91 d、第120 d。查看檢測卡的顯色情況和樣本測試情況，判定檢測卡的穩(wěn)定性，從而推斷保質(zhì)期。

1.3.7 檢測卡的特異性試驗(yàn)

特異性反應(yīng)指檢測卡檢測黃曲霉毒素總量和其他毒素類及其他族的被檢物質(zhì)（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、伏馬毒素、赭曲霉毒素、氯霉素、恩諾沙星、青霉素）時表現(xiàn)出的一系列反應(yīng)，通常用交叉反應(yīng)率來表示，交叉反應(yīng)率越低表明特異性越強(qiáng)。

1.3.8 檢測卡的假陽性率試驗(yàn)

取3批檢測卡，分別是LD120407、LD120409、LD120420檢測卡，每批檢測卡檢測陰性空白羊飼料、10 μg/kg添加混合標(biāo)準(zhǔn)（黃曲霉總類的各物質(zhì)濃度均為1 mg/ml）的羊飼料各50份，計算檢測卡的假陽性率。

1.3.9 檢測卡的假陰性率試驗(yàn)

取3批檢測卡，分別是LD120407、LD120409、LD120420檢測卡，每批檢測卡檢測20 μg/kg添加混合標(biāo)準(zhǔn)的羊飼料、50 μg/kg添加混合標(biāo)準(zhǔn)的羊飼料各50份，計算檢測卡的假陰性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金溶液的鑒定

圖1 膠體金溶液電鏡鑒定

由圖1可見，加膠體金顆粒大小比較均勻、形狀為圓形，經(jīng)計算該膠體金顆粒的大小為22 nm，符合膠體金顆粒制備和單克隆抗體標(biāo)記的要求。

2.2 抗體的標(biāo)記

圖2 抗體標(biāo)記蛋白濃度的確定

圖2的結(jié)果顯示，當(dāng)加入抗體蛋白的量為0～10 μg/ml抗體蛋白時，試管中的顏色為灰色和紫紅色，表明加入的抗體蛋白量不足；當(dāng)加入抗體蛋白量大于等于20 μg/ml的時候，試管中的顏色剛好趨于穩(wěn)定的紅色，表明加入的抗體蛋白量正好可以飽和吸附膠體金，在此基礎(chǔ)上再加上20%，即24 μg/ml為合適的抗體蛋白添加量。

2.3 檢測線和質(zhì)控線的確定

表1結(jié)果顯示，從經(jīng)濟(jì)角度講，質(zhì)控線濃度應(yīng)選擇0.4 mg/ml或者0.6 mg/ml，檢測線為0.6 mg/ml作為最佳的檢測線濃度。

表1 檢測線和質(zhì)控線的確定

2.4 試紙條的組裝

圖3 試紙條的組裝

圖3為試紙條的組裝示意圖，樣品墊、金標(biāo)墊、預(yù)包被的NC膜、吸水墊依次粘貼到PVC底板上進(jìn)行組裝，即為試紙條，將試紙條切割成4 mm寬的條子，放進(jìn)塑料卡殼中，壓緊為檢測卡。

2.5 檢測卡技術(shù)參數(shù)

2.5.1 檢測卡的最低檢測限確定

圖4 結(jié)果判定

表2 檢測卡的最低檢測限確定

根據(jù)圖4的陰陽性結(jié)果判定，由表2可知，本黃曲霉毒素總量檢測卡針對黃曲霉毒素B1的檢測限為10 μg/kg，與黃曲霉毒素其他結(jié)構(gòu)的交叉反應(yīng)率均大于20%，完全滿足GB2761—81允許量20 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.5.2 檢測卡的保質(zhì)期

圖5 檢測卡的保質(zhì)期測定

圖5顯示的是1～7分別為置于37℃第7 d、第14 d、第28 d、第56 d、第77 d、第91 d、第120 d的檢測卡顯色情況，可知黃曲霉毒素總量檢測卡在37℃下存放超過91 d以后，檢測線和質(zhì)控線的顏色深度變淺，偏離了原來的線條深度，據(jù)阿倫尼烏斯公式ln(k2/k1)=-Ea/R(1/T2-1/T1)推算，可知在37℃下存放77 d相當(dāng)于常溫存放18個月，這說明檢測卡在18個月的常溫存放下對整體質(zhì)量的影響并不明顯，故該檢測卡的保質(zhì)期為18個月。

2.5.3 檢測卡的特異性

由表3可以看出，黃曲霉毒素總量檢測卡對黃曲霉毒素類的交叉反應(yīng)率大于等于20%，而與不同族的其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)率小于1%，故該檢測卡對黃曲霉毒素總量的特異性最強(qiáng)。

表3 檢測卡的特異性

2.5.4 檢測卡的假陽性率

表4 三批黃曲霉毒素總量檢測卡假陽性率測定

表4顯示，100份批號為LD120407的檢測卡測試空白羊飼料和5 μg/kg添加羊飼料，只有一份為陽性，說明批號為LD120407的檢測卡的假陽性率為1%，經(jīng)計算，批號為LD120409和LD120420的檢測卡的假陽性率分別為3%和1%。

2.5.5 檢測卡的假陰性率

表5 三批黃曲霉毒素總量檢測卡假陰性率測定

表5顯示，批號為LD120407的檢測卡測試10 μg/kg添加羊飼料和20 μg/kg添加羊飼料的結(jié)果全部為陽性，說明批號為LD120306的檢測卡的假陰性率為0%，經(jīng)計算，批號為LD120409和LD120420的檢測卡的假陽性率分別為0%和0%。

3 結(jié)論

本研究的定性測定羊飼料中黃曲霉毒素總量殘留的高靈敏度檢測卡，對黃曲霉毒素B1的交叉反應(yīng)率為100%，而與同族的其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)率大于等于20%，與不同族的其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)率小于1%，最低檢測限為10 μg/kg。假陽性率小于5%，假陰性率為0%，密封好的檢測卡常溫下儲存，保質(zhì)期18個月。本卡可快速準(zhǔn)確地應(yīng)用于羊飼料中黃曲霉毒素總量殘留的定性檢測，為快速準(zhǔn)確地滿足定性測定羊飼料中黃曲霉毒素總量殘留。