活禽與飼料源沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥性對(duì)比研究

■張秀芹 杜柏林 韓文瑜

（1.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，遼寧沈陽 110016）

沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原菌，近些年，由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中大量應(yīng)用甚至濫用，導(dǎo)致動(dòng)物源沙門氏菌耐藥性不斷增加。張秀英等(2007)[1]的報(bào)道表明，從三個(gè)省分離的禽源沙門氏菌對(duì)阿莫西林、磺胺、復(fù)方新諾明、鏈霉素、四環(huán)素、萘啶酸及部分氟喹諾酮的耐藥率都在50%以上。馬孟根[2](2005)報(bào)道表明，在四川某豬場(chǎng)分離到的30株沙門氏菌對(duì)鏈霉素的耐藥率高達(dá)60%。本研究對(duì)遼寧省部分地區(qū)沙門氏菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)其進(jìn)行了耐藥性比較研究，為養(yǎng)殖業(yè)臨床用藥提供了參考依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

11株沙門氏菌菌株均由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，質(zhì)控菌株44113購自中國藥品生物制品檢定所。

普通營養(yǎng)瓊脂、膽硫乳瓊脂（DHL）、緩沖蛋白胨水(BPW)和亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司，invA基因引物[3]由寶生物工程（大連）有限公司合成；分子生物學(xué)反應(yīng)相關(guān)試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

腸桿菌科的生化鑒定試紙條ABI32E購自ABI公司，鑒定血清購自陸橋生物技術(shù)有限公司，藥敏板購自天津金章科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采樣

活禽樣采集：遼寧不同地區(qū)4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，采集泄殖腔拭子，4℃保存。

飼料樣品采集：銷售環(huán)節(jié)無菌采樣，避免樣品人為污染，常溫保存。

1.2.2 沙門氏菌的分離鑒定

1.2.2.1 增菌

泄殖腔拭子放入100 ml的SC中，37℃培養(yǎng)24 h；飼料樣品25 g放入225 ml BPW中,37℃培養(yǎng)18～24 h,取10 ml培養(yǎng)液加入100 ml SC中，培養(yǎng)24～48 h。

1.2.2.2 分離培養(yǎng)

將SC培養(yǎng)液分別接種于DHL和科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取DHL上中心黑色邊緣透明的菌落及科瑪嘉平板上的紫色菌落接種營養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)18～24 h進(jìn)行分離純化。

1.2.2.3 生化鑒定

用滅菌棉簽沾取純培養(yǎng)物，懸浮于3 ml滅菌生理鹽水中，制備成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙海褂米詣?dòng)加樣器將菌懸液滴入ABI32E試紙條反應(yīng)杯中，每個(gè)反應(yīng)杯中滴入55 μl，其余操作按試紙條要求完成。37℃培養(yǎng)18～24 h，用ABI細(xì)菌鑒定儀判讀結(jié)果。

1.2.2.4 分子生物學(xué)鑒定

將純化培養(yǎng)物進(jìn)行DNA抽提，利用invA基因引物[invA-F：TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC，R-：GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT]，按如下程序進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性2 min，30個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，58.4℃退火40 s，72℃延伸30 s；72℃終延伸7 min后4℃保存。擴(kuò)增片斷為331 bp。

1.2.2.5 分離株的血清型鑒定

將沙門氏菌可疑菌株進(jìn)行血清型鑒定，按沙門氏菌陽性血清使用說明書作血清型鑒定。

1.2.2.6 分離株的藥物敏感性試驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋（MIC）法，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clini?cal Laboratory Stands,NCCLS）推薦的操作步驟，對(duì)13種藥物進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。將沙門氏菌耐藥程度進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR方法和微生物培養(yǎng)方法共鑒定出11株沙門氏菌。飼料源8株，分別為6株姆班達(dá)卡、1株湯卜遜、1株雷根特沙門氏菌；禽源3株，分別為含有O1O4抗原的B群1株、乙型副傷寒沙門氏菌1株和斯坦利維爾沙門氏菌1株。PCR鑒定結(jié)果如圖1。

圖1 沙門氏菌分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

2.2 不同來源沙門氏菌耐藥程度分析(見表1、表2)

表1 沙門氏菌耐藥程度分析

表2 腸桿菌科標(biāo)準(zhǔn)菌株（44113）的耐藥濃度與敏感濃度（μg/ml）

從表1、2可以看出,飼料源沙門氏菌對(duì)10種藥物敏感性均高于禽源沙門氏菌,抑菌濃度低于禽源4～128倍不等，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于耐藥濃度，僅對(duì)臨床應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)的磺胺類和多西環(huán)素產(chǎn)生耐藥。而禽源沙門氏菌同時(shí)對(duì)10種藥物出現(xiàn)耐藥，且耐藥率達(dá)100%，僅對(duì)頭孢噻呋、黏桿菌素和氧氟沙星較為敏感。

耐藥程度與用藥情況關(guān)系密切。使用的抗菌藥物越多，產(chǎn)生的抗藥譜越廣[4]。養(yǎng)殖環(huán)節(jié)用藥品種多，數(shù)量大，時(shí)間長(zhǎng)，在長(zhǎng)期的藥物選擇壓力下，沙門氏菌的耐藥情況日益嚴(yán)重。相關(guān)研究表明，分離的沙門氏菌株多表現(xiàn)為多重耐藥[5-6]。本研究表明，飼料源沙門氏菌對(duì)大多數(shù)藥物敏感，而禽源沙門氏菌卻對(duì)大部分藥物耐藥。復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑等是市場(chǎng)上使用較早的抗菌藥物，禽源與飼料源沙門氏菌對(duì)上述兩種藥物易產(chǎn)生耐藥性，這說明耐藥程度與用藥情況存在必然聯(lián)系。