多糖硫酸酯化修飾及其抗凝血作用研究進(jìn)展

尹馨梓，張佩華，2，陳士國(guó)，葉興乾*

1浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室，杭州310058;

2浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，杭州310013

硫酸酯化多糖是一類單糖分子上羥基被硫酸根取代的多糖，也稱硫酸多糖或多糖硫酸酯。硫酸多糖具有廣泛的生物活性，除最主要的抗凝血［1］作用外，還具有抗腫瘤［2］、抗病毒［3］，抗HIV［4］活性等，而且大多無(wú)毒［5］，因而受到極大的關(guān)注。硫酸酯化多糖包括天然和化學(xué)修飾的硫酸多糖［6，7］，包括從海洋多糖，肝素，植物中提取的各種硫酸多糖以及人工合成的多糖硫酸酯。硫酸酯化多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)其生物活性有著重要的影響［8］，因而其構(gòu)效關(guān)系在國(guó)內(nèi)外得到重點(diǎn)關(guān)注和研究［9］。

抗凝血活性是硫酸多糖的一個(gè)非常重要的生物活性，近幾年硫酸多糖抗凝血作用的構(gòu)效關(guān)系也成為熱點(diǎn)之一。本文就近幾年天然以及合成的硫酸多糖的修飾方法、多糖硫酸酯以及硫酸多糖的抗凝血活性及其影響因素、構(gòu)效關(guān)系等方面進(jìn)行綜述。

1 硫酸化方法

對(duì)不含有或者含有硫酸基量少的物質(zhì)進(jìn)行硫酸化修飾就是化學(xué)法硫酸化多糖的過(guò)程。硫酸化過(guò)程，即磺酸基團(tuán)與多糖的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)的過(guò)程。整個(gè)反應(yīng)體系主要包括酯化劑和溶劑兩部分。常用的酯化劑主要有:濃硫酸、氯磺酸、三氧化硫、二氧化硫和氧氣等。但是這些酯化劑存在共同的缺點(diǎn):它們的酸性太強(qiáng)，在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致多糖分子鏈發(fā)生強(qiáng)烈的降解。為了降低多糖分子鏈的水解和降解，且同時(shí)提高多糖的溶解性，有機(jī)溶解常常搭配酯化劑使用。傳統(tǒng)常用的有機(jī)溶劑有:DMSO、DMF、吡啶、甲苯、三乙胺、甲酰胺等［11］，下面介紹一些常用的硫酸酯化的方法。

1.1 N(SO3Na)3 法［10］

以及亞硫酸氫鈉和亞硝酸鈉合成的近似中性的醋化劑N(SO3Na)3在水溶液中與多糖反應(yīng)由E.F.Paschall 于1956 年首次使用，N(SO3Na)3被證實(shí)是一種溫和的硫酸酯化試劑，且發(fā)生的硫酸酯化反應(yīng)相對(duì)不劇烈，引起的降解范圍較小，同時(shí)低污染、低消耗，因而最近得到廣泛關(guān)注。

1.2 氯磺酸-甲酰胺法［11，12］

氯磺酸-甲酰胺法是O’Neill，A.N.與1955 年首次使用的。主要步驟是將多糖懸浮于無(wú)水甲酰胺中，攪拌，在室溫下逐漸加入酯化試劑氯磺酸，反應(yīng)結(jié)束后，用NaOH 中和除氨，透析，濃縮，乙醇沉淀，沉淀經(jīng)干燥即得。此方法是一種較為理想的硫酸酯化方法，但是被證實(shí)可能引起多糖的部分降解。

1.3 氯磺酸-吡啶法［13，14］

將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸瓶置鹽水-冰浴中，加入吡啶，攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入一定量的氯磺酸，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，然后加入多糖粉末，迅速將三頸瓶移人沸水浴中，恒溫?cái)嚢? h，冷至室溫，將反應(yīng)液傾入冰水中，中和后加入乙醇，析出沉淀，將沉淀溶于水透析72小時(shí)，過(guò)濾，濾液經(jīng)冷凍干燥后得多糖硫酸化產(chǎn)物。該方法硫酸酯化試劑廉價(jià)易得，硫酸酯化效果較好。

1.4 其他方法

其他的硫酸酯化方法的方法還包括三氧化硫-吡啶法［15］、三氧化硫-三甲胺鹽［16］，三氧化硫-DMF法［17，18］，濃硫酸法［19］等。

2 硫酸多糖的抗凝血活性

肝素是最早，也是已經(jīng)比較廣泛地用于臨床的抗凝血?jiǎng)?0］。但是研究顯示:肝素在具有抗凝血活性的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生許多不可預(yù)見的副作用［21］，如:抗血小板活性，可引發(fā)不正常的流血現(xiàn)象［22，23］;以及由于動(dòng)物源提取，人畜間朊病毒、瘋牛病感染的幾率增加等［24，25］。肝素在抗凝血作用與分子結(jié)構(gòu)的特異性、硫酸基含量以及負(fù)電性有關(guān)［26］。近年來(lái)，根據(jù)肝素抗凝血機(jī)理制備得到的硫酸多糖由于其低副作用，傳染疾病幾率小等的特點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注和研究。天然硫酸多糖和化學(xué)法硫酸化多糖都具有較好的抗凝血活性。

2.1 天然硫酸多糖

硫酸酯基及其負(fù)電性對(duì)抗凝血活性有著重要的影響，而海洋生物中的多糖含有豐富的硫酸酯基，是天然硫酸多糖最豐富最廣泛的來(lái)源。含有天然硫酸多糖的海洋生物包括海洋植物中的藻類(紅藻、褐藻、綠藻、水草)，海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中的海膽，海參，海鞘等。這些天然硫酸多糖抗凝血活性在過(guò)去的研究中都得到了不同程度的證明，海洋生物是抗凝血活性物質(zhì)的良好來(lái)源［26，27］;海草中的一種硫酸多糖(SPSG)被證實(shí)也有良好的抗凝血活性［28］。APTT和PT 測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明，SPSG 具有顯著的抗凝血活性，且比試驗(yàn)肝素APTT 高2.5 倍，這個(gè)數(shù)據(jù)首次證明了從海草上提取的硫酸多糖的生物活性。霞水母提取物對(duì)小鼠抗凝血作用也有影響［29］，有研究顯示，霞水母提取物能不同程度地延長(zhǎng)小鼠體內(nèi)凝血時(shí)間、出血時(shí)間和體外凝血時(shí)間，能顯著提高小鼠的APTT 和PT。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其他生物中含有天然硫酸多糖，實(shí)驗(yàn)證明其也具有良好的抗凝血活性。陳士國(guó)［30］等對(duì)海參硫酸軟骨素和美國(guó)肉參進(jìn)行了體外抗凝血活性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的海參硫酸軟骨素樣品以及美國(guó)肉參均具有較強(qiáng)的抗凝血活性，兩個(gè)樣品的APTT 和TT 實(shí)驗(yàn)延長(zhǎng)時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)肝素相近，且無(wú)非正常的流血現(xiàn)象。

肝素是被應(yīng)用最早也是最廣泛的抗凝血藥物，但是普通肝素具有一定副作用，針對(duì)此，將天然肝素一定程度降解得到低分子量肝素近幾年得到廣泛的關(guān)注和研究。有研究對(duì)低分子量進(jìn)行制備，且分離出高活性高純度的低分子肝素，硫含量提高了0.828%［31］，抗凝血活性增強(qiáng)，因而減少用量，從而降低了副作用。水蛭中的也有抗凝血成分，提取結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷、乙酸乙酯、水溶液提取部分均有不同程度的抗凝血藥理活性，乙酸乙酯部分的抗凝血效果最強(qiáng)［32］。刺松藻多糖也能顯著延長(zhǎng)家兔血漿APTT、PT 和TT;顯著抑制由二磷酸腺苷(ADP)引起的家兔血小板聚集［33］。

2.2 化學(xué)法硫酸化多糖

有些具有抗凝血活性的多糖，在脫去硫酸根以后，活性也隨之消失或減弱。同時(shí)，也有些多糖因硫酸根的引入而明顯增強(qiáng)了其抗凝血活性。一些不具有硫酸基團(tuán)的多糖，如甲殼素，瓜爾豆膠，魔芋多糖等在修飾后具有較好的抗凝血效果。有實(shí)驗(yàn)表明，硫酸根對(duì)硫酸多糖生物活性的發(fā)揮起關(guān)鍵作用，尤其是抗凝血活性。

陳士國(guó)［34］等采用三氧化硫吡啶-二甲亞砜體系對(duì)北太平洋魷魚墨多糖(SIP)及其三乙胺鹽進(jìn)行硫酸酯化。研究表明:硫酸酯化對(duì)魷魚墨多糖的單糖組成影響不大，但是分子量降低，硫酸酯化后，糖單元數(shù)與硫酸基的摩爾比約為3∶2。凝血活性分析表明，它具有較好的延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)的效果。而對(duì)比未硫酸酯化過(guò)的魷魚墨多糖(不含硫酸基團(tuán))的無(wú)明顯抗凝血活性，推斷得出化學(xué)法硫酸化修飾成功增加了抗凝血活性。Lihong Fan［35］等通過(guò)N(SO3Na)3在水中與果膠多糖進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行硫酸酯化，取得了反應(yīng)的最優(yōu)條件(反應(yīng)pH 為6，反應(yīng)溫度為60°C，反應(yīng)時(shí)間12 h，亞硝酸鈉和果膠的摩爾質(zhì)量比為2.5/190mol/g)，并獲得果膠硫酸酯。紅外光譜，核磁共振證明硫酸基成功結(jié)合上，活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)實(shí)驗(yàn)證明樣品有良好的抗凝血活性。對(duì)可食用的白樹花真菌進(jìn)行發(fā)酵，提取水溶性多糖，采用氯磺酸-吡啶法進(jìn)行硫酸酯化修飾，可以獲得水溶性的白樹花多糖硫酸酯。APTT 、TT 以及凝血因子活性均說(shuō)明白樹花多糖硫酸酯具有明顯的抗凝血活性，僅在5 mg/L 的濃度下即可發(fā)揮效果，在10 mg/L 濃度時(shí)，相當(dāng)于150U 肝素的抗凝血效果［36］。

除了加入硫酸根基團(tuán)，還有其他化學(xué)修飾的方法可以增加其抗凝血活性。宋玉民［37］等:以甲苯二異氰酸酯(TDI)中的-NCO 基與納米金屬氧化物表面的羥基發(fā)生反應(yīng)，得到改性納米金屬氧化物，并使其與肝素鈉進(jìn)行接枝反應(yīng)生成肝素雜化材料。肝素雜化材料的抗凝血時(shí)間和復(fù)鈣時(shí)間均比肝素鈉的要短，表明它的抗凝血性比肝素鈉的抗凝血性要弱一些;但比納米金屬氧化物和空白組的抗凝血時(shí)間和復(fù)鈣時(shí)間要長(zhǎng)，說(shuō)明肝素雜化材料的抗凝血性與其相比則有明顯的提高。

3 硫酸多糖的構(gòu)效關(guān)系

多糖的生物大分子結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)更為復(fù)雜，多糖主鏈和支鏈的性質(zhì)以及高級(jí)結(jié)構(gòu)影響多糖的生物學(xué)活性。多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指糖基的組成、排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭物的構(gòu)型及糖鏈有無(wú)分支，分支位置與長(zhǎng)短等。二級(jí)三級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)是建立在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，所形成的各種氫鍵、聚合體、空間結(jié)構(gòu)等等。所以硫酸多糖構(gòu)效關(guān)系的研究主要集中在糖基組成、糖基的連接方式以及糖基與硫酸基的連接方式上。

機(jī)體的自身的抗凝功能主要依靠的抗凝物質(zhì)是絲氨酸蛋白酶抑制物，包括抗凝血酶III(AT-III)，和肝素輔因子(HC II)［38］，兩者對(duì)凝血酶和凝血因子進(jìn)行抑制，進(jìn)而抑制凝血。多糖硫酸酯具有多負(fù)電荷特性，而AT-III 由于分子中存在賴氨酸和精氨酸殘基，有高密度的正電荷，二者可以非特異性結(jié)合，從而激活A(yù)T-III，因此一定的陰離子電子密度對(duì)抗凝血作用非常重要［39］;而HC II 主要通過(guò)誘導(dǎo)凝血酶與之形成1:1 穩(wěn)定復(fù)合物，從而使凝血酶失去蛋白水解酶活性，硫酸皮膚素的參與下，可催化加快速度。硫酸多糖的結(jié)構(gòu)與相關(guān)凝血物質(zhì)等的特異性結(jié)合導(dǎo)致了不同的抗凝血效果，因而研究硫酸多糖與凝血物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系，作用機(jī)理在近些年來(lái)得到國(guó)際上的廣泛關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)。

3.1 多糖的單糖組成及糖苷鍵類型

主鏈的糖單元組成、糖苷鍵類型直接決定多糖的活性，支鏈的類型、聚合度、在多糖鏈上的分布及其取代度決定多糖活性的強(qiáng)弱。有研究表明多糖的活性與α 或β 構(gòu)型無(wú)關(guān)，與單糖種類無(wú)關(guān)，但與糖苷鍵的構(gòu)型有關(guān)，鄰近位置的硫酸基團(tuán)也會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化［40］。對(duì)于(1～3)連接的多糖，6 位硫酸基的存在影響多糖的抗凝血活性，而對(duì)(1-4)連接的多糖硫酸基團(tuán)的位置對(duì)多糖的活性卻沒(méi)有影響。Mao等［41］從一種綠藻提取到硫酸多糖，這種硫酸多糖基含量很高(主要是1，2 位連接的L-鼠李糖)，硫酸基團(tuán)主要在C-3 和/或C-4 位，這與1991 年Maeda等［42］發(fā)現(xiàn)的M.nitidum 在組成上很相近，但是結(jié)構(gòu)卻有著截然的不同，主要是鼠李糖連接方式的不同。研究發(fā)現(xiàn)，這種新發(fā)現(xiàn)的硫酸多糖與M. nitidum 的抑制凝血因子并不相同，且凝血效果相差很大。

3.2 多糖分子量

根據(jù)研究報(bào)道，硫酸多糖的分子量是抑制凝血級(jí)聯(lián)形成復(fù)雜的一個(gè)主要因素，對(duì)抗凝血活性有著重要影響［43］。低分子量肝素通過(guò)β 消除降解法從普通肝素中得到，經(jīng)過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，得到的低分子量肝素的分子量范圍:分子量小于2000 的占17.5%，分子量大于8000 的占71.1%［31］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)降解后的三種低分子量肝素與未修飾之前相比，IC50值分別降低了3.3、8.7 和2.4 倍，說(shuō)明降解后，抗凝血活性大大增強(qiáng)了。然而一般情況下，對(duì)于硫酸多糖，分子量與抗凝效果呈正相關(guān)。然而，超高分子量可能限制硫酸果膠組分的擴(kuò)散和吸收進(jìn)入血液的過(guò)程。Thales R.Cipriani 等［43］對(duì)不同分子量的硫酸酯化果膠進(jìn)行抗凝血活性的研究，結(jié)果表明，低分子量和高分子量的硫酸酯化果膠結(jié)構(gòu)相似，都具有a (1→4)-linkedα-D-GalpA 結(jié)構(gòu)，但高分子量硫酸酯化果膠的樣品抗凝血效果更好，并且副作用更小。而Lihong Fan 等［35］在制備了不同分子量的硫酸酯化果膠多糖(分別為16、20、23 KDa)后測(cè)定了它們的抗凝血活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子量為20 KDa 的硫酸酯化多糖的抗凝血效果最好，分子量再增加，則效果出現(xiàn)降低。

沈元［44］采用近似中性的酯化劑三磺酸鈉胺(N(SO3Na)3)與季銨化合物(QACS)反應(yīng)，制備了季銨化合物硫酸酯(QACSS)。并對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外及核磁表征，證明了QACSS 的結(jié)構(gòu)。出其分子量分別為1.40 ×104，2.51 ×104 和3.80 ×104?？鼓钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，QACSS 的APPT，PT 及TT 值都高于正常值，說(shuō)明QACSS 具有抗凝血活性;分子量為2.51 ×104 的QACSS 具有最好的抗凝血活性。

3.3 硫酸基含量及其取代度

硫酸基取代度的含義為每二糖單位中的硫酸基含量。實(shí)驗(yàn)表明，多糖硫酸酯的作用與其取代度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)性。一般來(lái)說(shuō)，硫酸根含量在每個(gè)糖殘基平均1.5～2.0 時(shí)最佳，因而發(fā)生雙硫取代反應(yīng)對(duì)抗凝血活性的貢獻(xiàn)較大。同時(shí)，硫酸根取代度僅僅是一方面，其他因素如取代位置和特定基團(tuán)對(duì)抗凝血活性也有重要影響［45］。低分子量的褐藻多糖硫酸酯(50 KDa)兼具良好的抗凝血活性和更弱的血小板激活作用［46］。

Hatem Majdoub［47］通過(guò)聚氨酯泡沫超濾從螺旋藻培養(yǎng)基中提取的粗多糖組分并用DEAE-纖維素陰離子交換層析，得到多糖PUF1 和PUF2。測(cè)定硫酸根含量的結(jié)果表明PUF2 的硫酸根含量(20%)大于原粗螺旋藻培養(yǎng)基的胞外多糖(5%)，測(cè)定抗凝血活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比與PUF1 和原未提取的粗螺旋藻培養(yǎng)基的胞外多糖，PUF2 有很高的活性，甚至比硫酸皮膚素的抗凝血活性高。羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯通過(guò)羧甲基化、磺化等進(jìn)行化學(xué)修飾后，抗凝血實(shí)驗(yàn)表明磺化取代度大于0.35 的羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯能拮抗內(nèi)源性凝血途徑，并且在一定范圍內(nèi)，羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯的抗凝血活性隨著羧甲基取代度、磺化取代度和分子量的增加而增加［48］。

3.4 硫酸基的取代位置

不同來(lái)源的硫酸多糖抗凝血活性有很大的差別，這不僅在于多糖的種類不同，而且和硫酸基在多糖的取代位置有很大的關(guān)系。Mulloy 等［49］對(duì)硫酸軟骨素通過(guò)核磁共振分析發(fā)現(xiàn)，保持硫酸基取代度不變，將硫酸軟骨素B C-4 位上的硫酸基變?yōu)镃-6位硫酸基，其抗凝血活性完全喪失，實(shí)驗(yàn)表明C-4 位上的硫酸基發(fā)揮著抗凝血作用。

Mour?o PA.［50］在對(duì)褐藻的研究中發(fā)現(xiàn)2，4-二硫酸基團(tuán)在抗血栓調(diào)節(jié)過(guò)程中有增強(qiáng)效果的作用。(從2-sulfated，3-linked α-L-fucans 到2，4-disulfated α-L-fucans 硫酸基含量增加了1.8 倍，活性卻增加了38 倍);且特定的硫酸基結(jié)合位點(diǎn)決定了同血漿中絲氨酸蛋白酶抑制劑特異性結(jié)合。而單一的在3位連接α-L-巖藻糖位發(fā)生C-4 位硫酸根的修飾對(duì)肝素輔因子II 介導(dǎo)的凝血酶抑制非常重要，C-2 位硫酸根的修飾卻有破壞抗凝血作用的性質(zhì)。陳士國(guó)等［34］采用紅外光譜和一維核磁技術(shù)對(duì)硫酸酯化后多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，硫酸酯化主要發(fā)生在N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的4、6 位上。進(jìn)一步的抗凝血實(shí)驗(yàn)表明，樣品的抗凝血效果很顯著。Roberto［51］研究了過(guò)硫酸化的硫酸軟骨素和巖藻糖基化的硫酸軟骨素對(duì)凝血系統(tǒng)的作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)硫酸化的硫酸軟骨素是在葡萄糖醛酸殘基的2-和3-位發(fā)生硫酸化;同樣，在半乳糖醛酸殘基上的4-和6-位也發(fā)生了不同程度的硫酸化，其他硫酸基團(tuán)被化學(xué)硫酸化反應(yīng)結(jié)合上。而巖藻糖基化的硫酸軟骨素由海參中提取，它的主干部分和硫酸軟骨素很接近，支鏈部分還有2，4-二硫酸巖藻糖殘基。巖藻糖基化的硫酸軟骨素的凝血效果比過(guò)硫酸化的硫酸軟骨素高很多，因而硫酸根的取代位置對(duì)其抗凝血活性有著重要的影響。

4 結(jié)論與展望

硫酸多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)。其廣泛的來(lái)源和豐富的種類使其結(jié)構(gòu)的研究成為研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)硫酸多糖的探索集中在兩方面，一是尋找到新的，更廣泛，效用更高，副作用更小的來(lái)源，同時(shí)也在尋找修飾效果更好副作用更小的硫酸酯化方法;一方面對(duì)抗凝血活性良好、來(lái)源廣泛的硫酸多糖進(jìn)行機(jī)理的進(jìn)一步探索。國(guó)內(nèi)外對(duì)硫酸多糖的結(jié)構(gòu)和功能之間的構(gòu)效關(guān)系的探索還在繼續(xù)。硫酸多糖的作用位點(diǎn)、活性中心、介導(dǎo)物質(zhì)、作用凝血因子及其可能帶來(lái)一些凝血方面的副作用需要進(jìn)一步的研究，這對(duì)更有重點(diǎn)和目的性地應(yīng)用硫酸多糖帶來(lái)技術(shù)支持。隨著研究水平和技術(shù)的提高，更多深入、清楚的機(jī)理研究將為硫酸多糖的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系奠定更為深的基礎(chǔ)，也為硫酸多糖的廣泛應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的依據(jù)。

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