牙鲆有絲分裂雌核發(fā)育二倍體的遺傳特性分析

許丹丹，劉永新，王桂興，劉奕，王玉芬，劉海金、

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100039;3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，河北秦皇島066100;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

牙鲆有絲分裂雌核發(fā)育二倍體的遺傳特性分析

許丹丹1、3，劉永新2，王桂興3，劉奕4，王玉芬3，劉海金2、3

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100039;3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，河北秦皇島066100;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

對(duì)牙鲆Paralichthys olivaceus有絲分裂雌核發(fā)育后代進(jìn)行了遺傳差異分析，并將其與同一母本的減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體和普通二倍體進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:有絲分裂雌核發(fā)育二倍體可分為兩部分，即純合子 (Mitotic-A）和雜合子 (Mitotic-B）;Mitotic-A、Mitotic-B、減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體 (MGD）和牙鲆普通二倍體 (ND）的平均純合度分別為1.000 0、0.328 4、0.252 1、0.183 3，4個(gè)群體的親代與子代之間的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.707 1、0.874 8、0.894 0、0.660 2，子代個(gè)體間的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.546 0、0.792 1、0.836 6、0.675 9，這表明Mitotic-A 與Mitotic-B具有完全不同的遺傳特征;Mitotic-B在poli110TUF、poli1906TUF位點(diǎn)純合個(gè)體所占的比例較高 (34.10%、73.86%），而MGD在這兩個(gè)位點(diǎn)全部表現(xiàn)為雜合 (0、0），Mitotic-B在 poli1490TUF、poli1498TUF位點(diǎn)純合個(gè)體所占的比例較小(10.23%、9.66%），而MGD在這兩個(gè)位點(diǎn)全部表現(xiàn)為純合 (100%、100%），這說(shuō)明誘導(dǎo)方式不同，重組交換的結(jié)果則不同。研究表明，Mitotic-B與MGD雖然都是雜合子，由于誘導(dǎo)方式不同，導(dǎo)致其遺傳特征也不同。

牙鲆;有絲分裂雌核發(fā)育;減數(shù)分裂雌核發(fā)育;微衛(wèi)星;雜合子

牙鲆Paralichthys olivaceus是中國(guó)海水養(yǎng)殖中占有重要地位的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。中國(guó)于20世紀(jì)90年代開(kāi)始人工養(yǎng)殖牙鲆，對(duì)牙鲆的相關(guān)研究取得了一定的成果［1-2］。關(guān)于牙鲆雌核發(fā)育的研究，國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)報(bào)道［3-8］。日本學(xué)者 Yamamoto［3］曾利用有絲分裂雌核發(fā)育技術(shù)成功克隆出牙鲆。

誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育是通過(guò)抑制第一次卵裂而形成，其染色體組中一條染色體是以另一條為模板復(fù)制而成，遺傳組成在理論上為純合，但是在誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育的后代檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，除純合子(Mitotic-A）存在外，還有部分雜合子 (Mitotic-B）的存在［4-5］。朱曉琛等［6］利用微衛(wèi)星鑒定了有絲分裂雌核發(fā)育牙鲆幼體的純合性;季旭等［7］用親子鑒定的方法對(duì)數(shù)尾純合子進(jìn)行了家系鑒別;劉海金等［5，8］用微衛(wèi)星標(biāo)記比較了有絲分裂雌核發(fā)育牙鲆與減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體的遺傳差異。但是，迄今未見(jiàn)關(guān)于有絲分裂雌核發(fā)育中雜合子群體遺傳特征的報(bào)道。本研究中，作者利用微衛(wèi)星標(biāo)記比較有絲分裂雌核發(fā)育中Mitotic-B與減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體 (meiotic gynogenetic diploid，MGD）的遺傳差異，并與Mitotic-A和普通二倍體 (normal diploid，ND）進(jìn)行比較，旨在為分析有絲分裂雌核發(fā)育的遺傳特性以及Mitotic-B在育種上的利用提供基礎(chǔ)材料和遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

利用同一尾牙鲆親魚(yú)的卵子，分別對(duì)其誘導(dǎo)減數(shù)分裂和有絲分裂雌核發(fā)育，雌核發(fā)育誘導(dǎo)參照劉海金等［8］的方法。同時(shí)，以同一親本的卵子與一尾普通牙鲆的精子人工授精，制備普通二倍體作為對(duì)照組。分別剪取牙鲆親本及減數(shù)分裂雌核發(fā)育30尾個(gè)體、普通二倍體30尾個(gè)體、有絲分裂雌核發(fā)育280尾個(gè)體的胸鰭鰭條，用于遺傳特征分析。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 DNA提取參照Salah等［9］的方法略有改動(dòng)。將剪碎的胸鰭置于400 μL裂解液 ［100 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA(pH 8.0），1%SDS，200 mg/L的蛋白酶K］中，于50℃下消化3 h至澄清，用等體積的飽和酚-氯仿混合液抽提一次，用等體積的異丙醇沉淀，再用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇清洗沉淀，用TE溶解后，于冰箱 (-20℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物 從 Casta?o-Sánchez 等［10］繪制的牙鲆二代遺傳連鎖圖譜中選取48個(gè)位于連鎖群端部區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記，每個(gè)連鎖群各選取兩個(gè)標(biāo)記，獲得微衛(wèi)星引物序列。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，合成規(guī)格為3OD。引物名稱、引物序列、退火溫度、連鎖群等見(jiàn)表1。

表1 引物序列、特異退火溫度和連鎖群Tab.1 The sequence of microsatellite primers，specific annealing temperature and linkage group in the experiment

續(xù)表1 引物序列、特異退火溫度和連鎖群Cont.Tab.1 The sequence of microsatellite primers，specific annealing temperature and linkage group in the experiment

1.2.3 PCR和電泳 PCR反應(yīng)體系共15 μL，包括 10 ×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+1 μL，2 mmol/L dNTPs 1 μL，10 mmol/L上、下游引物各0.6 μL，模板 1 μL(30 ～ 50 ng），Taq DNA 聚合酶1 U，用ddH2O補(bǔ)至15 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s，54～63℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用1%的硝酸銀染色10 min，顯色液 (1% 甲醛，2%氫氧化鈉，0.04%無(wú)水碳酸鈉，均為體積分?jǐn)?shù)）顯色10 min。凝膠在HP scanjet G4010掃描儀上成像，用Gel-Pro Analyzer 4.5軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分析電泳圖，將電泳條帶為1條的檢測(cè)個(gè)體在該位點(diǎn)視為純合，電泳條帶為2條的個(gè)體在該位點(diǎn)視為雜合［11］，然后分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)的雜合子比例。用PopGene 3.2軟件統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù) (Na）、有效等位基因數(shù) (Ne）、群體純合度 (Ho）、群體雜合度 (He）、多態(tài)性信息含量(PIC），以及親本與子代和子代與子代之間的遺傳相似系數(shù) (GSI）。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星分析

利用48對(duì)引物分別對(duì)Mitotic-A、Mitotic-B、MGD和ND群體進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在有絲分裂雌核發(fā)育280尾牙鲆群體中，104尾牙鲆在所檢測(cè)的48個(gè)位點(diǎn)全部純合，176尾牙鲆在48個(gè)位點(diǎn)部分純合。由表2可見(jiàn):從Mitotic-A中隨機(jī)選取30尾個(gè)體進(jìn)行分析，Mitotic-A在所檢測(cè)的48個(gè)位點(diǎn)都表現(xiàn)為純合;Mitotic-B在每個(gè)位點(diǎn)均有純合的個(gè)體存在，但不存在全部位點(diǎn)均純合的個(gè)體，故稱之為“雜合子”，其中純合個(gè)體所占比例最多的位點(diǎn)為 poli1421TUF(171/176），最少的為 poli1819TUF(13/176）;MGD在30個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為全部雜合，在其他位點(diǎn)存在不同數(shù)量純合的個(gè)體，與有絲分裂雌核發(fā)育二倍體明顯不同;ND僅有個(gè)別位點(diǎn)純合的個(gè)體，不存在全部位點(diǎn)均純合的個(gè)體。Mitotic-B在poli110TUF、poli1906TUF位點(diǎn)純合個(gè)體所占的比例較高 (34.10%、73.86%），而MGD在這兩個(gè)位點(diǎn)全部表現(xiàn)為雜合 (0、0）;Mitotic-B在poli1490TUF、poli1498TUF位點(diǎn)純合個(gè)體所占的比例較低 (10.23%、9.66%），而MGD在這兩個(gè)位點(diǎn)全部表現(xiàn)為純合 (100%、100%）。這一現(xiàn)象說(shuō)明，盡管二者出自同一親本，但是在同一位點(diǎn)表現(xiàn)出的純合性卻明顯不同，說(shuō)明有絲分裂雌核發(fā)育與減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體具有不同的遺傳特性。

2.2 4個(gè)群體的遺傳多樣性

從表3可見(jiàn):ND群體的平均 Na、平均 Ne、平均 He、平 均 PIC 分別 為 2.979 2、2.719 9、0.816 7、0.524 0，均比雌核發(fā)育群體的高，平均Ho為0.183 3，比雌核發(fā)育群體的低;Mitotic-B的平均Ho為0.328 4，比MGD群體的高;Mitotic-B與Mitotic-A的Na、Ne、PIC含量基本相近，但二者的純合度則相差較大。因此，Mitotic-A是一個(gè)純合子，而Mitotic-B是一種比MGD純合度高的雜合子。

2.3 4個(gè)群體的遺傳相似系數(shù)

4個(gè)群體的親本與子代、子代與子代之間的遺傳相似系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示 (表4）:Mitotic-A的親本與子代的遺傳相似系數(shù)為0.707 1，反映出雌核發(fā)育的特征，即固定母本性狀的作用;子代之間的遺傳相似系數(shù)僅為0.546 0，反映出每一個(gè)Mitotic-A都具有一套獨(dú)立的基因組，互不相同的特點(diǎn)，故相似度低。Mitotic-B的親本與子代、子代與子代之間遺傳相似系數(shù)分別為0.874 8、0.792 1，均比Mitotic-A高，與其雜合度高相一致。ND群體的親本與子代之間的遺傳相似系數(shù)均比雌核發(fā)育的低，由此表明，ND群體與雌核發(fā)育的遺傳特征顯著不同。

3 討論

為了避免不同親本對(duì)誘導(dǎo)雌核發(fā)育所產(chǎn)生遺傳差異的影響，本研究中將同一尾親魚(yú)的同一批卵子分成3部分，同時(shí)制備了兩種雌核發(fā)育和一種正常受精的子代，以便于進(jìn)行相同遺傳背景下的比較。在280尾有絲分裂雌核發(fā)育二倍體中，有104尾(占37%）為Mitotic-A，有176尾為 Mitotic-B，說(shuō)明兩種群體的純合度不同，遺傳特征不同。同一尾母本，同一批卵子，誘導(dǎo)方法相同卻出現(xiàn)兩種不同的純合度，這可能是由其他方面的原因造成的，其成因有待于進(jìn)一步研究。

關(guān)于有絲分裂雌核發(fā)育牙鲆的純合性，劉海金等［8］報(bào)道了有絲分裂雌核發(fā)育與減數(shù)分裂雌核發(fā)

育二倍體的區(qū)別，在有絲分裂雌核發(fā)育的后代檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有部分雜合個(gè)體的存在［4-5］，提出有絲分裂雌核發(fā)育二倍體中雜合子的比例存在變化問(wèn)題［5，12］，但是，對(duì)于其雜合子的遺傳特征卻沒(méi)有討論。本研究中，把沒(méi)有雜合位點(diǎn)的個(gè)體稱為純合子，而把具有雜合位點(diǎn)的個(gè)體稱為雜合子。將有絲分裂雌核發(fā)育中出現(xiàn)的雜合子與減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體進(jìn)行比較，Mitotic-B與MGD雖然都是雜合子，但是由于誘導(dǎo)方式不同，獲得雜合位點(diǎn)不同，純合度不同，遺傳相似系數(shù)亦不相同，最后反映出二者的遺傳特征不同。本研究結(jié)果表明，雖用同一母本，但有絲分裂雌核發(fā)育雜合子與減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體的遺傳特性不同，呈現(xiàn)以下特點(diǎn):1）Mitotic-B與MGD的純合度不同，Mitotic-B的純合度為0.328 4，MGD為0.252 1。2）在同一位點(diǎn)上純合程度也不同，有的甚至全部表現(xiàn)為雜合，如Mitotic-B在poli110TUF、poli1906TUF位點(diǎn)純合個(gè)體所占的比例較高 (34.10%、73.86%），而MGD在這兩個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為雜合;Mitotic-B在poli1490TUF、poli1498TUF位點(diǎn)純合個(gè)體所占的比例較低 (10.23%、9.66%），而MGD在這兩個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為純合。3）Mitotic-B的親代與子代之間的遺傳相似系數(shù)比MGD低。究其原因，可能是由于減數(shù)分裂雌核發(fā)育是通過(guò)抑制第二極體排出而形成，其染色體組由雌性原核和第二極體構(gòu)成;而有絲分裂雌核發(fā)育則是通過(guò)抑制第一次卵裂而形成，可能是受某種影響而形成雜合，其染色體組的構(gòu)成與減數(shù)分裂不同。

表4 4個(gè)群體親本與子代以及子代與子代之間的遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic similarity between parents and offsprings and among offsprings in the four groups

有關(guān)雜合子出現(xiàn)的原因，可能是因?yàn)槁炎影l(fā)育具有不同步現(xiàn)象，在進(jìn)行有絲分裂雌核發(fā)育的過(guò)程中，當(dāng)施加靜水壓力使染色體加倍時(shí)，某些延遲發(fā)育的卵子仍處在減數(shù)分裂期，從而靜水壓抑制了第二極體排出而不是抑制第一次卵裂，形成了減數(shù)分裂雌核發(fā)育［5］。Komen等［4］也認(rèn)為，雜合子的出現(xiàn)可能與受精的時(shí)間和卵子發(fā)育在物理上的不同步有關(guān)。另一方面，靜水壓處理的副作用與卵子的質(zhì)量和發(fā)育狀態(tài)也是影響雌核發(fā)育誘導(dǎo)效果的重要因素。對(duì)于有絲分裂雌核發(fā)育二倍體中出現(xiàn)雜合子的現(xiàn)象，除了誘導(dǎo)條件、時(shí)機(jī)等外源因素外，親本的遺傳差異也可能對(duì)雜合子的形成產(chǎn)生影響［13］，一方面影響雜合位點(diǎn)組成，另一方面影響雜合位點(diǎn)的比例，即雜合度。目前，關(guān)于有絲分裂雌核發(fā)育的成功事例不多，對(duì)其有數(shù)據(jù)支持的論證分析還很少。可以推想，隨著誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育的成功率逐漸提高，對(duì)其純合和雜合的認(rèn)識(shí)將會(huì)更加全面和準(zhǔn)確。

誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育是獲得牙鲆純系的一種有效方法，可為獲得克隆牙鲆的親本奠定基礎(chǔ)。然而，在利用有絲分裂雌核發(fā)育個(gè)體作為克隆親本之前，需要分別檢測(cè)其個(gè)體的純合性，如不加區(qū)分地誘導(dǎo)，也不可能全部成為克隆。有關(guān)有絲分裂雌核發(fā)育雜合子產(chǎn)生的具體原因是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入研究。

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The genetic characteristics of mitotic gynogenesis diploid in Japanese flounderParalichthysolivaceus

XU Dan-dan1，3，LIU Yong-xin2，WANG Gui-xing3，LIU-Yi4，WANG Yu-fen3，LIU Hai-jin2，3
(1.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;2.Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100039，China;3.Beidaihe Central Experiment Station，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qinhuangdao 066100，China;4.Animal Science and Technology College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The genetic characteristics were compared between meiosis gynogenetic diploid(MGD）and normal diploid(ND）of Japanese flounderParalichthys olivaceususing microsatellite marker.The results showed that the offsprings of mitotic gynogenesis were divided into homozygote(Mitotic-A）diploids and heterozygote(Mitotic-B）diploids.There was average homozygosity of 1.000 0 in Mitotic-A，0.328 4 in Mitotic-B，0.252 1 in MGD and 0.183 3 in ND.The genetic similarity between the parents and progenies were found to be 0.707 1 in Mitotic-A，0.874 8 in Mitotic-B，0.894 0 in MGD and 0.660 2 in ND.The genetic similarity among progenies was shown to be 0.546 0 in Mitotic-A，0.792 1 in Mitotic-B，0.836 6 in MGD，and 0.675 9 in ND，indicating that there are significant differences in genetic characteristics between the Mitotic-A and Mitotic-B.The proportion of homozygous individuals was 34.10%in Mitotic-B and 73.86%at the poli110TUF and poli1906TUF loci，but 0 in MGD and 0 performance for heterozygosis completely.The homozygous individuals were found to represent 10.23%in Mitotic-B and 9.66%in the poli1490TUF and poli1498TUF loci，but to account for 100%in MGD and 100%performance for homozygosis completely.The findings show that there are different induction and information exchange approaches in Mitotic-B and MGD.

Paralichthys olivaceus;mitotic gynogenesis;meiosis gynogenesis;microsatellite marker;heterozygote

S917

A

2095-1388(2013）06-0542-07

2013-04-18

國(guó)家鲆鰈類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng) (CARS-50-G2）;國(guó)家公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)專(zhuān)項(xiàng) (200903046）

許丹丹 (1986-），女，碩士研究生。E-mail:xudandan25@163.com

劉海金 (1951-），男，研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail:liuhaijin2005@126.com