刺參Y－box基因的克隆與表達(dá)分析

田燚，張丙龍，常亞青，董萍萍，陳百堯，伏光輝，安建

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.連云港市海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇連云港222044;3.連云港市海珍品增養(yǎng)殖試驗(yàn)場，江蘇連云港 222044）

刺參Y－box基因的克隆與表達(dá)分析

田燚1，張丙龍1，常亞青1，董萍萍1，陳百堯2、3，伏光輝2、3，安建2、3

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.連云港市海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇連云港222044;3.連云港市海珍品增養(yǎng)殖試驗(yàn)場，江蘇連云港 222044）

為了探究Y－box基因在刺參Apostichopus japonicus胚胎發(fā)育及性別分化中的作用，根據(jù)已有的EST序列，通過RACE技術(shù)克隆了刺參Y－box基因的cDNA全長序列，并利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)行了表達(dá)模式分析。結(jié)果表明:刺參Y－box基因cDNA全長為1 142 bp，5'端UTR為102 bp，3'端UTR為215 bp，開放閱讀框 (ORF）為825 bp;Y－box基因cDNA全長編碼274個(gè)氨基酸的前體蛋白，預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量為31 100，理論等電點(diǎn)為9.46，是親水性蛋白;刺參Y－box氨基酸序列包含氨基酸N末端結(jié)構(gòu)域、C末端結(jié)構(gòu)域和冷休克結(jié)構(gòu)域 (CSD），其中CSD區(qū)在Y－box結(jié)合蛋白家族中非常保守;刺參Y－box結(jié)合蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)沒有α－螺旋和β－折疊，無規(guī)則卷曲占87.23%，延伸鏈占12.77%;刺參與其他物種的Y－box氨基酸的相似度為27%～41%，在冷休克區(qū)相似度很高，達(dá)到75%以上;構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，刺參與加州海兔Aplysia californica、櫛孔扇貝Chlamys farreri、玻璃海鞘Ciona intestinalis聚為一支，為海洋無脊椎動(dòng)物;經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測，Y－box基因在小耳幼體中表達(dá)水平最高，且顯著高于其他各發(fā)育階段(P＜0.05），在雄性性腺中的表達(dá)量顯著高于雌性性腺 (P＜0.05）。研究表明，Y－box基因在刺參的胚胎發(fā)育及性別分化中發(fā)揮重要作用。

刺參;Y－box基因克隆;序列分析;基因表達(dá)

Y－box結(jié)合蛋白是從細(xì)菌到人類都高度保守的多功能蛋白家族，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、選擇性剪接、DNA修復(fù)、翻譯調(diào)控、細(xì)胞增殖和再生等多方面具有重要作用［1－5］。關(guān)于Y－box結(jié)合蛋白家族生物學(xué)功能的研究很多，其中包括冷適應(yīng)功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能和蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控功能等。真核生物中Y－box結(jié)合蛋白在轉(zhuǎn)錄激活和抑制兩個(gè)方面發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。低溫下，Y－box基因mRNA能夠成功合成冷休克蛋白，而其他蛋白質(zhì)的翻譯過程則被阻止［6］。有研究表明，在多數(shù)動(dòng)物組織中均能檢測到Y(jié)－box基因的表達(dá)，高表達(dá)量出現(xiàn)在肝臟、卵巢和睪丸組織中［7］。

刺參Apostichopus japonicus又名仿刺參，在中國主要分布于黃渤海海域，屬典型的溫帶種，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的海產(chǎn)品，現(xiàn)已成為中國北方沿海重要的養(yǎng)殖品種之一［8－9］。目前，關(guān)于刺參性別分化及決定相關(guān)功能基因的研究相對較少。龐振國等［10］研究了二硫蘇糖醇對刺參卵母細(xì)胞體外成熟的影響;田燚等［11］克隆了刺參性別相關(guān)基因P450c17并進(jìn)行了序列分析;臧云鵬［12］進(jìn)行了刺參性別差異的研究;隋娟等［13］研究了刺參vasa－1ike基因在組織中的表達(dá)。為了進(jìn)一步了解刺參的性別決定和分化的分子機(jī)制，本研究中克隆了刺參Y－box基因，分析其氨基酸序列，預(yù)測蛋白質(zhì)的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，探討其在不同組織、不同發(fā)育時(shí)間和性腺中的表達(dá)情況，旨在為刺參的性別決定機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參取自大連市瓦房店海區(qū)，在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周后開始試驗(yàn)。刺參體質(zhì)量為 (24.15±0.17）g，養(yǎng)殖用水為沙濾海水，pH為7.98，鹽度為31。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol法提取刺參體腔液的總RNA，RNA的濃度及完整性利用紫外分光光度計(jì)與10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，符合要求后于－80℃下保存?zhèn)溆?，并按照BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書的方法合成SMART cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系:總RNA 100 ng，5×M－MLV Buffer 2 μL，RTase MMLV(200U/μL）0.25 μL，oligo(dT）1 μL，dNTP 0.5 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL）0.25 μL，用水定容至10 μL。將RNA于65℃下變性后冰浴，在冰上迅速加入上述成分后于42℃下水浴，于70℃下保溫后冰上冷卻，獲得cDNA第一條鏈。1.2.2 RACE擴(kuò)增及產(chǎn)物的克隆和測序 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已獲得的EST序列 (GH550810.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RACE的特異性引物F、R(表1）。利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒，進(jìn)行刺參Y－box基因cDNA全長的克隆。反應(yīng)體系共25 μL，包括cDNA 1 μL，引物各 0.5 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ExDNA聚合酶0.25 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性60 s，54℃下退火60 s，72℃下延伸10 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后于72℃下再延伸10 min，4℃下保存。5'RACE以oligo(dT）為引物，合成cDNA第一鏈，用R引物擴(kuò)增基因的5'末端。PCR反應(yīng)體系同上。將cDNA片段回收后，將與載體連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α中，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，為陽性的克隆送寶生物工程 (大連）有限公司進(jìn)行測序。

表1 基因克隆及表達(dá)所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the gene clone and expression

1.2.3 序列分析 采用Blast軟件進(jìn)行序列同源性比對和相似性搜索;用DNAman軟件進(jìn)行序列拼接，用NCBI上的 ORF Finder尋找開放閱讀框(ORF）;利用Tmhmm軟件預(yù)測跨膜域;用Target P 1.1 Server程序進(jìn)行信號肽查找;用Bioedit軟件分析Y－box結(jié)合蛋白的氨基酸組成，采用Smart軟件查找蛋白特征模體;用ExPASy server軟件分析蛋白質(zhì)性質(zhì);用 DNAman開展多序列比對，用Psipred預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用I－TASSER Server預(yù)測蛋白的3D結(jié)構(gòu);用Mega 4.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000次重復(fù)計(jì)算自展分析值。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測刺參Y－box基因的時(shí)空表達(dá) 采用RT－PCR方法，檢測Y－box基因在不同發(fā)育階段的定量表達(dá)情況。利用Trizol法分別提取刺參的受精卵、囊胚、原腸胚、小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體、樽形幼體、五觸手幼體、稚參、雌性性腺和雄性性腺的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。每組樣品均設(shè)3個(gè)平行，利用引物Y－box－R和Y－box－F對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，以cytb為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)的引物為cytb－F和cytb－R(表1）。PCR反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行28個(gè)循環(huán);最后在72℃下再延伸5 min，4℃下保存。

2 結(jié)果

2.1 RACE擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，經(jīng)RACE擴(kuò)增獲得了與預(yù)期大小一致的目的片段 (圖 1），其中 Marker為DL2000。

圖15'RACE和3'RACE的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification product of 5'RACE and 3'RACE

2.2 刺參Y－box基因cDNA全長序列

將刺參Y－box基因的EST(GH550810.1）片段與 RACE獲得的cDNA序列進(jìn)行拼接，獲得1 142 bp的基因cDNA全長 (圖2）。在起始密碼子ATG的－3位為 A，符合Kozak規(guī)律。cDNA的5'端 UTR 為102 bp，3'端 UTR 為215 bp，ORF為825 bp。堿基A、T、C、G的偏好性分析表明，Y－box基因cDNA全長序列的堿基A占33.3%，堿基G占28.7%，堿基T占16.4%，堿基C占21.6%。將刺參Y－box基因cDNA全長與斑馬魚Danio rerio、玻璃海鞘Ciona intestinalis、大西洋鮭Salmo salar、櫛孔扇貝Chlamys farreri、虹鱒Oncorhynchus mykiss、金魚Carassius auratu、大菱鲆Scophthalmus maximus、非洲爪蟾蜍Xenopus tropicalis等物種的序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，3'和5'端的UTR在不同物種中差異較大，但是刺參Y－box基因cDNA全長序列的ORF序列長度和相似度與其他物種基本一致。

圖2 刺參Y－box基因cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Full－length cDNA and the deduced amino acid sequence of Y－box gene in sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3 刺參Y－box結(jié)合蛋白的氨基酸組成特征

刺參Y－box基因cDNA全長可編碼274個(gè)氨基酸的前體蛋白，理論等電點(diǎn)為9.46，預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量為31 100。其中有54個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸 (K、R），47個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸 (D、E），42個(gè)疏水氨基酸 (A、I、L、F、W、V），70個(gè)不帶電荷的極性氨基酸 (N、C、Q、S、T、Y），分子式為C1302H2079N451O438S2。以 ProtScale程序?qū)?Y－box cDNA編碼的氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第21～31、53～55、76～83、226～229殘基為疏水性的，第5～18、32～37、39～52、56～72、84～94、96～225、230～270殘基為親水性的。Y－box結(jié)合蛋白疏水性最大值為1.922，親水性最大值為3.822，親水性殘基比例遠(yuǎn)大于疏水性殘基，因此，推測其編碼蛋白是親水性的。

將刺參與大西洋鮭、櫛孔扇貝、斑馬魚、金魚、大菱鲆、玻璃海鞘、虹鱒、鮑魚Haliotis diversicolor、加州海兔Aplysia californi、青鳉Oryzias latipes等物種的Y－box結(jié)合蛋白進(jìn)行了比較分析，等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)分子量基本一致，具有較高的同一性，尤其是CSD區(qū)相似度較高，進(jìn)一步說明此區(qū)域的高度保守性。

采用Signal P軟件預(yù)測刺參的Y－box氨基酸序列，不存在信號肽，故推測Y－box不屬于分泌性蛋白。利用Tmhmm預(yù)測Y－box結(jié)合蛋白的跨膜域，Y－box無明顯跨膜區(qū)，不屬于跨膜蛋白類。對其糖基結(jié)合位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，Y－box氨基酸序列存在1個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)，推測Y－box結(jié)合蛋白可能是糖蛋白。

2.4 刺參Y－box結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對于保持蛋白質(zhì)的功能非常重要，不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)將導(dǎo)致不同的功能。預(yù)測刺參Y－box結(jié)合蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成了蛋白質(zhì)中較大的結(jié)構(gòu)元件，其中無規(guī)則卷曲占87.23%，延伸鏈占12.77%，不含α－螺旋和β－折疊。刺參Y－box結(jié)合蛋白具有氨基酸C末端結(jié)構(gòu)域、N末端結(jié)構(gòu)域和冷休克結(jié)構(gòu)域(CSD），其中CSD是高度保守的核苷酸結(jié)合域，由68個(gè)氨基酸組成，主要負(fù)責(zé)與損傷DNA和非特異性DNA結(jié)合，參與自身或異源的聚合。結(jié)構(gòu)域中包含有 RNP－1(GYGFINR）和 RNP－2(EDVFVHQS）兩個(gè)RNA結(jié)合基序 (圖3），這兩個(gè)基序與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能密切相關(guān)。

圖3 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列比對的部分結(jié)果Fig.3 The comparison of partial amino acid sequences of Y－box in sea cucumber with other species

2.5 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用GenBank上已公布的Y－box氨基酸序列進(jìn)行多序列的比對，使用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖4可見:刺參與加州海兔 (NP00－1191560）、櫛孔扇貝 (ACF90219.1）、玻璃海鞘(NP001072010.1）聚為一支，為海洋無脊椎動(dòng)物，其聚類的結(jié)果與其進(jìn)化地位一致;大西洋鮭(NP001133216.1）、虹鱒(NP001158512.1）、斑馬魚(AAI68507.1）、非洲爪蟾蜍(NP001016677.1）、原雞 (NP989745.1）、小家鼠 (AAH27785.1）、人(NP001138898）、七鰓鰻 (ACF33226.1）、金魚(BAA19850.1）聚為一支，為脊椎動(dòng)物;搖蚊(AAN10049.1）與果蠅(XP002048507.1）聚為一支，為陸地?zé)o脊椎動(dòng)物。

圖4 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the sea cucumber and other species based on Y－box sequences

2.6 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列的同源性

將刺參與其他物種的Y－box氨基酸序列進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果表明，其相似度為27%～41%，在CSD區(qū)相似度很高，達(dá)到75%以上 (圖3）。研究結(jié)果表明，具有重要作用的氨基酸殘基在保持蛋白質(zhì)功能方面是高度保守的，而維持結(jié)構(gòu)的殘基則是相對保守的。

2.7 刺參Y－box基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)

以cytb為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測Y－box基因在刺參不同發(fā)育階段的表達(dá)。結(jié)果表明:Y－box基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá)，其中小耳幼體階段表達(dá)水平最高，且顯著高于其他發(fā)育階段 (P＜0.05）;在雄性性腺中的表達(dá)量顯著高于雌性性腺 (P＜0.05）(表2）。

3 討論

3.1 刺參Y－box基因的組成特性及結(jié)構(gòu)域預(yù)測

為963 bp，編碼320個(gè)氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為66%，CSD保守結(jié)構(gòu)域的相似度為75%;金魚［14］Y－box基因家族中 Y－box1全長為1 430 bp，ORF為936 bp，編碼311個(gè)氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為66%，CSD保守結(jié)構(gòu)域的相似度為75%;金魚［14］Y－box2 全長為 1 503 bp，ORF為894 bp，編碼297個(gè)氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為60%，CSD保守結(jié)構(gòu)域的相似度為75%;日本青鳉［15］Y－box1全長為1 464 bp，ORF為921 bp，編碼306個(gè)氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為75%，CSD保守結(jié)構(gòu)域的相似度為76.5%。研究結(jié)果表明，高度保守的氨基酸殘基在保持蛋白質(zhì)功能方面是非常必要的，而維持其結(jié)構(gòu)作用的殘基則是相對保守的。

本研究中獲得的刺參Y－box基因cDNA全長為1 142 bp，ORF為825 bp，可編碼274氨基酸的前體蛋白。刺參Y－box基因cDNA含有一個(gè)保守的CSD區(qū)域，此區(qū)域與其他物種氨基酸的相似度在75%以上。到目前為止，Y－box基因已經(jīng)在很多水產(chǎn)動(dòng)物中獲得，如金魚［14］、日本青鳉［15］、加州海兔［16］、日 本 七 鰓 鰻［6］、 玻 璃 海 鞘［17］、 大 西 洋鮭［18］、櫛孔扇貝［19］、斑馬魚［20］等。其中:加州海兔［16］Y－box基因 cDNA 全長為1 723 bp，ORF為762 bp，編碼253個(gè)氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為75%，CSD保守結(jié)構(gòu)域的相似度為85%;玻璃海鞘［17］Y－box基因cDNA全長為1 852 bp，ORF

表2 刺參Y－box基因mRNA在不同發(fā)育階段的表達(dá)Tab.2 Quantitative real－time PCR analysis of Y－box gene expression in different developmental stages in sea cucumber Apostichopus japonicus

3.2 刺參Y－box結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

Y－box屬于多功能的DNA/RNA結(jié)合蛋白，其前體蛋白包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域［14］:富含大量的丙氨酸和脯氨酸的氨基酸N末端，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的激活;冷休克結(jié)構(gòu)域，一般包含大約70個(gè)氨基酸殘基，高度保守，含有 RNP－1(GYGFINR）和 RNP－2(EDVFVHQT）兩個(gè)RNA結(jié)合基序［1］，是其蛋白質(zhì)識別RNA的結(jié)合位點(diǎn);C末端結(jié)構(gòu)域，其氨基酸由酸性氨基酸與堿性氨基酸交替組成，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)蛋白與蛋白、蛋白與RNA之間的相互作用。

刺參Y－box結(jié)合蛋白具有氨基酸N末端結(jié)構(gòu)域、C末端結(jié)構(gòu)域和冷休克結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)都符合Y－box前體蛋白的氨基酸序列特征。其中冷休克結(jié)構(gòu)域由68個(gè)氨基酸組成，是高度保守的核苷酸結(jié)合域，保守的冷休克結(jié)構(gòu)域決定了Y－box結(jié)合蛋白的重要功能［17］。刺參高度保守的結(jié)構(gòu)域也進(jìn)一步證明了在進(jìn)化過程中，保持蛋白質(zhì)功能的殘基比維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的殘基更加保守。N末端氨基酸組成的不同是Y－box結(jié)合蛋白分子間的最大區(qū)別，但N末端具體如何行使其功能目前尚不清楚［21］。刺參N－末端氨基酸組成的不同，可能負(fù)責(zé)調(diào)控刺參Y－box結(jié)合蛋白特異結(jié)合轉(zhuǎn)錄過程中的其他蛋白質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。刺參的C末端氨基酸結(jié)構(gòu)域，由酸性氨基酸與堿性氨基酸交替組成，推測此區(qū)域與蛋白以及蛋白與RNA之間的相互作用有關(guān)。目前已知C末端的親水結(jié)構(gòu)域主要通過精氨酸束與鄰近分子中的酸性螺旋相互作用，實(shí)現(xiàn)結(jié)合蛋白間的聚合［14］。

3.3 刺參Y－box基因的位點(diǎn)分析與同源性分析

預(yù)測的刺參Y－box結(jié)合蛋白不屬于分泌性蛋白，這與人Y－box結(jié)合蛋白的功能很相似。人Y－box結(jié)合蛋白通常在細(xì)胞基質(zhì)與細(xì)胞核之間穿梭，以應(yīng)激顆粒的形式存在于細(xì)胞基質(zhì)中，主要功能是處理加工并輸出mRNA，在細(xì)胞核中Y－box結(jié)合蛋白受到應(yīng)激反應(yīng)以后會發(fā)生移動(dòng)，包括腺病毒感染、DNA 損傷和 PI3K－Akt信號激活等［22－25］。

刺參Y－box氨基酸序列與其他物種具有相對較高的相似性，尤其是CSD區(qū)，這種高度的保守性說明Y－box基因在刺參的生命活動(dòng)中具有重要作用。正是因?yàn)榫哂邢嗤谋Ｊ貐^(qū)和功能域才決定了刺參與其他物種的Y－box結(jié)合蛋白具有功能上的相同。Y－box結(jié)合蛋白作為重要的多功能轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控蛋白，表現(xiàn)為它在結(jié)構(gòu)上高度的保守性。刺參Y－box氨基酸序列CSD區(qū)中保守的68個(gè)氨基酸，可能在刺參Y－box基因進(jìn)化中起到穩(wěn)定其功能的作用。

3.4 刺參Y－box基因的定量表達(dá)分析

Y－box基因在刺參不同發(fā)育階段的定量表達(dá)結(jié)果表明，Y－box基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá)，刺參Y－box基因的這種組成型表達(dá)方式也從另一個(gè)角度說明其功能的多樣性。在小耳幼體中Y－box基因的表達(dá)水平最高，且顯著高于其他發(fā)育階段，這可能是因?yàn)樾《鸂钣左w是刺參個(gè)體發(fā)育中第一個(gè)變態(tài)時(shí)期，也是個(gè)體發(fā)育中時(shí)間最長，形態(tài)學(xué)和組織器官初步形成的時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期表達(dá)量高可能與其在這個(gè)階段的重要變化密切相關(guān)，同時(shí)從另一個(gè)側(cè)面反映了Y－box基因是一個(gè)多功能的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控因子。

Y－box基因在刺參雄性性腺中的表達(dá)量顯著高于雌性性腺，推測Y－box基因可能與刺參的性別分化及決定有一定關(guān)系，此結(jié)果還需要進(jìn)一步證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，Y－box結(jié)合蛋白在金魚的精細(xì)胞里表達(dá)非常高［19］，是一種特別的精子RNA結(jié)合蛋白，而在非洲爪蟾蜍中Y－box基因作為精細(xì)胞的特別轉(zhuǎn)錄因子抑制翻譯。在小鼠卵母細(xì)胞中Y－box結(jié)合蛋白占總蛋白的2%［20］，而在小鼠精子細(xì)胞中占0.7%［26］，且缺少Y－box結(jié)合蛋白的小鼠形態(tài)生長發(fā)育正常但不育［27］。本研究結(jié)果將有助于推進(jìn)刺參的Y－box基因在胚胎發(fā)育及其性別調(diào)控分化的研究工作。

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Molecular cloning and expression analysis of Y－box gene in sea cucumberApostichopus japonicus

TIAN Yi1，ZHANG Bing－long1，CHANG Ya－qing1，DONG Ping－ping1，
CHEN Bai－yao2，3，F(xiàn)U Guang－h(huán)ui2，3，AN Jian2，3
(1.Key Laboratory of Mariculture＆ Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China;2.Ocean and Fishery Science Research Institute of Lianyungang City，Lianyungang 222044，China;3.Seafood Breeding Farm of Lianyungang City，Lianyungang 222044，China）

The cDNA length of Y－box gene in sea cucumberApostichopus japonicuswas clones by RACE technique based on the EST sequence in the GenBank，and the expression of Y－box gene in sea cucumber was studied by fluorescent quantitative PCR to elucidate the role of Y－box gene in embryonic development and sexual differentiation in the sea cucumber.The results showed that the Y－box has cDNA length of 1 142 bp encoding 274 amino acids constituting hydrophilic precursor protein with 31 100 protein molecular weight with an isoelectric point of 9.46 and included a 825 bp open reading frame(ORF），a 215 bp 3'UTR and a 102 bp 5'UTR.The N－glycosylation site，hydrophilic C－tail end and cold shock domain CSD were evaluated，and the Y－box protein family was very conservative in CSD domain.The secondary structure of the precursor protein consisted primarily of a 12.77%strand chain and 87.23%random coil，without β folding and alpha helix.The comparison revealed that the similarity of the Y－box precursor protein was ranged from 27%to 41%with other animals.The evolutionary tree indicated that the Y－box precursor protein of sea cucumber was clustered with sea hareAplysia californica，AscidianCiona intestinalisand Zhikong scallopChlamys farreri.The Y－box gene expression in different developmental stages and gonads showed that there was significantly higher expression of the Y－box gene in early auricularia than in other stages(P＜0.05），and higher in testis than in ovary(P＜0.05），indicating that the Y－box gene play an important role in embryonic development and sexual differentiation in the sea cucumber.

Apostichopus japonicus;Y－box gene cloning;sequence analysis;gene expression

S917.4

A

2095－1388(2013）06－0535－07

2013－03－04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (41106128）;國家“863”計(jì)劃重大項(xiàng)目 (2012AA10A412）;江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2012421）

田燚 (1979－），女，副教授。E－mail:tianyi@dlou.edu.cn

常亞青 (1967－），男，教授。E－mail:yqchang@dlou.edu.cn