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    從獼猴肝臟組織擴(kuò)增黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因片段

    2013-02-05 07:31:08唐東紅罕圓圓羅云王城寬黃英畢正生葉尤松
    關(guān)鍵詞:黃嘌呤獼猴核苷酸

    唐東紅,罕圓圓,羅云,王城寬,黃英,畢正生,葉尤松

    (1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118;2.云南省中醫(yī)學(xué)院,昆明 650200)

    黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(xanthine dehydrogenase/oxidase,XDH/XO)是一種非特異性需氧脫氫酶,人類的XDH/XO 酶在嘌呤代謝過程中催化嘌呤代謝的最后兩步,從黃嘌呤和次黃嘌呤形成尿酸代謝產(chǎn)物終產(chǎn)物尿酸,在尿酸的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用,是體內(nèi)核酸代謝中一種非常重要的酶。在生物進(jìn)化過程中,人類及部分靈長類體內(nèi)尿酸氧化酶失活[1,2],尿酸成為嘌呤代謝的終產(chǎn)物,它起到組織免受氧化損傷的作用。

    XDH/XO 的分布有物種和組織特異性,狗和小鼠心肌內(nèi)XDH/XO 活性很高,兔和豬心肌內(nèi)XDH/XO 活性很低,在人體及靈長類動(dòng)物體內(nèi)XDH/XO主要分布于肝臟組織,其次為小腸,其余組織例如一些上皮細(xì)胞中的含量不足前兩者含量的3%[3]。研究證實(shí),高尿酸狀態(tài)下,XO 活性也增加,血尿酸水平增高,24 h 尿酸排泄量相應(yīng)增加,持續(xù)的高尿酸血癥狀態(tài)可引起組織器官發(fā)生相應(yīng)的病變,誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性皮下結(jié)節(jié)、腎結(jié)石等疾病,而且血尿酸水平與高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、脂代謝紊亂、心力衰竭及腦梗死等許多心血管疾病密切相關(guān),增加心血管疾病和糖尿病死亡率[4-6],高尿酸血癥和痛風(fēng)為嚴(yán)重危害人類健康的代謝類疾病,從尿酸代謝途徑的各個(gè)環(huán)節(jié)分析,XDH/XO 是尿酸生成過多的高尿酸血癥的一個(gè)主要發(fā)病原因。目前,XDH/XO 抑制劑是治療高尿酸血癥的主要藥物之一,如別嘌呤醇(Allopurinol)。但該藥物在常規(guī)劑量(300 mg)下藥效的局限性及較大的臨床副作用,在一定程度上限制了別嘌呤醇在治療高尿酸血癥中的應(yīng)用。近年來,研究者以XDH/XO 為靶點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)了一些活性化合物對其有一定的抑制作用,例如Jeongmi 等[7]發(fā)現(xiàn)多種中草藥混合提取物含有的多酚類和黃酮類能夠抑制肝臟XO活性,更多的有效的XO 競爭型抑制劑類藥物還有待于進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步開展高尿酸血癥致病機(jī)理及開發(fā)控制血液尿酸水平的抗高尿酸血癥新藥,建立體內(nèi)XDH/XO mRNA 及XDH/XO 蛋白表達(dá)水平的監(jiān)測方法意義重大。

    本實(shí)驗(yàn)選取由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國醫(yī)學(xué)靈長類研究中心飼養(yǎng)的獼猴的新鮮肝臟組織,進(jìn)行肝組織總RNA 的提取,參照GenBank:U39487.1 人類hXDH/XO 基因編碼序列cDNA 序列作為參考,設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR 對獼猴XDH/XO 基因進(jìn)行擴(kuò)增,并對擴(kuò)增后所獲得的基因片段進(jìn)行序列分析及生物信息學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為下一步在獼猴中開展高尿酸血癥致病機(jī)理研究,抗高尿酸血癥新藥研發(fā)奠定一定的工作基礎(chǔ)。

    1 材料方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    1 只雄性普通級獼猴,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國醫(yī)學(xué)靈長類中心提供[SCXK(滇)2010-0003],7.6 kg,8 周齡,實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所進(jìn)行[SYXK(滇)2010-0007]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過,批準(zhǔn)號為(2011)-003,同時(shí)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

    1.2 主要試劑與儀器

    Trizol 試劑(invitrogen 公司),PrimeScript RT reagent Kit(大連寶生物工程有限公司),Premix Ex Taq 酶(大連寶生物工程有限公司),DL2000 DNA marker(大連寶生物科技有限公司),梯度PCR 儀(Bio-Rad,USA),SS-325 高壓蒸氣滅菌箱(Tomy,Japan),PowerPac Basic 電泳儀(Bio-Rad,USA),凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad,USA),ND-1000 紫外分光光度計(jì)(DanoDrop,USA)。

    1.3 PCR 引物設(shè)計(jì)與合成

    引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI 提供的人類XDH/XO 核苷酸序列(U39487.1),利用Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),擴(kuò)增其CDS 區(qū)域,所設(shè)計(jì)的上游引物為:5'-CCTTTTCTGAATCAGGCAGGAGCCC-3,下游引物為:5'-CAGTCGCGGAGCAGGGACAC-3',目的片段大小為683 bp,由大連寶生物科技有限公司合成。

    1.4 獼猴新鮮肝臟組織的獲得及肝組織總RNA的提取

    對猴號為030408305 的獼猴進(jìn)行肝臟組織活體穿刺,獲得少量肝組織,約50 mg。將50 mg 新鮮肝臟組織在液氮中碾磨成粉末后,加入0.5 mL Trizol,充分裂解后加0.2 mL 氯仿,劇烈震蕩后置冰上,出現(xiàn)分層后于4℃13 500 r/min離心30 min,轉(zhuǎn)移水相,加等體積預(yù)冷異丙醇,放置-20℃1 h 后,于4℃13 500 r/min離心30 min,離心管底可見RNA沉淀。經(jīng)75%乙醇洗脫后,將RNA 沉淀置于室溫自然干燥,用20 μL DEPC 處理水溶解后,于65℃變性5 min,取0.15 μL 總RNA 提取液于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀察28 S 和18 S RNA 條帶亮度,分析RNA 的完整性,ND-1000 紫外分光光度計(jì)測定A260/A280nm,分析純度、RNA 濃度。

    1.5 RT-PCR

    根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行。每10 μL 體系中依次加入5 ×PrimeScript Buffer 2 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL,Oligo dT Primer 0.5 μL,Random 6 mers 0.5 μL,總RNA(濃度稀釋為500 ng/μL)1 μL,RNase Free dH2O 5.5 μL,逆轉(zhuǎn)錄條件為:37℃,45 min,85℃,30 s,4℃,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA 為模板進(jìn)行XDH/XO 基因的PCR 擴(kuò)增:反應(yīng)體系為25 μL。分別加上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)、模板cDNA 5 μL、滅菌去離子水5.5 μL、Premix Ex Tag 12.5 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,93℃變性30 s、65.5℃退火30 s、72℃延伸30 s、33 個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠影像分析儀下觀察所擴(kuò)增的目的片段。

    1.6 目的片段基因的序列測定

    將RT-PCR 產(chǎn)物送百泰克生物科技公司測序,測序結(jié)果使用ChromasPro 軟件進(jìn)行堿基序列拼接,利用DNAMAN 軟件對目的基因核苷酸進(jìn)行分析。

    1.7 基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

    采用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模。利用生物信息學(xué)工具interproscan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對所獲得的XDH/XO 核苷酸序列進(jìn)行基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 獼猴肝臟組織總RNA 的提取

    從獼猴新鮮肝臟組織提取的總RNA 進(jìn)行電泳,結(jié)果可觀察到見28 S、18 S、5 S 三條帶,見圖1,說明所提取的總RNA 無降解,可進(jìn)一步用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所提取的總RNA 樣品經(jīng)Nanodrop-1000 超微量核酸測定儀測定,A260/A280nm 值為1.94,介于1.8 ~2.0 之間時(shí),說明純度較高。

    圖1 獼猴肝臟組織總RNA 電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA from the liver tissue of rhesus macaque

    2.2 獼猴XDH/XO 基因RT-PCR 檢測結(jié)果

    肝組織的RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳,結(jié)果擴(kuò)增出目的條帶,與所設(shè)計(jì)的片段大小一致,結(jié)果見圖2。

    圖2 RT-PCR 電泳結(jié)果Fig.2 Result of electrophoresis of the RT-PCR products

    2.3 基因測序結(jié)果及序列分析

    送由上海生物工程有限公司進(jìn)行單向測序,測序波峰圖略。序列共測到683 個(gè)核苷酸,編碼208個(gè)氨基酸,相對分子質(zhì)量為22 721,包括了1 個(gè)編碼53 個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF),見圖3。DNAMAN 對目的基因核苷酸序列與NCBI 報(bào)道的人類(Homo sapiens,U39487.1)mRNA 核苷酸序列、小鼠Mus musculus(NM0111723.2)、家鼠Rattus norvegicus(NM 017154.4)、野豬Sus scrofa (JN896312.1)XDH/XO 基因mRNA 核苷酸序列同源性進(jìn)行同源性比較分析,見圖4,其中與人類同源性最高,為95.32%,與小鼠、家鼠、野豬同源性分別為84.94%、84.53%、85.94%。圖5 顯示了不同物種XDH/XO 基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹。

    圖3 獼猴XDH/XO 基因片段序列測定結(jié)果Fig.3 Results of sequencing XDH/XO gene fragments in the rhesus monkey

    2.4 SWISS-MODEL 及InterProScan 構(gòu)建XDH/XO 基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)及預(yù)測結(jié)構(gòu)域

    圖6 顯 示SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建XDH/XO 基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)。圖7 顯 示InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)預(yù)測的結(jié)構(gòu)域功能,結(jié)果顯示該段XDH/XO 編碼蛋白含有醛氧化/脫氫酶的鉬喋呤結(jié)合點(diǎn)結(jié)構(gòu)域(Aldehyde oxidase/xanthine dehydrogenase molybdopterin binding domain)、黃嘌呤脫氫酶結(jié)構(gòu)域(Xanthine dehydrogenase domain)。

    3 討論

    目前研究者已對人、鼠、果蠅、蚊、貓等多種動(dòng)物的XDH/XO 基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究及染色體定位[8-12],繪制出人類XDH/XO(hXDH/XO)基因在位于2p22的一個(gè)單基因座上,有報(bào)道顯示hXDH/XO 基因有三種不同的cDNA 序列[13],小鼠的XDH/XO(mXDH/XO)基因在位于17 號染色體短臂上,與昆蟲的XDH/XO(mXDH/XO)基因結(jié)構(gòu)有很大差異。

    研究已證實(shí)[3],哺乳動(dòng)物體內(nèi)該酶主要利用NAD+作為電子受體以黃嘌呤脫氫酶的形式存在,它是XO 的前體,相對無活性,但當(dāng)組織處于缺血低氧等病理情況下,就可以轉(zhuǎn)化為該酶的另一種形式XO,XO 可利用分子氧作為電子受體,在一定的條件并釋放大量的反應(yīng)性氧代謝物使活性大大提高并催化組織中由于缺氧不能進(jìn)一步代謝和分解而積聚的黃嘌呤氧化反應(yīng),例如組織在低氧狀況下的再?zèng)_氧,從而產(chǎn)生大量的自由基。自由基對體內(nèi)細(xì)胞膜、DNA、蛋白質(zhì)均有害[14]。XDH/XO 是由兩個(gè)催化活性互不依賴的、相同的亞單位組成的同型二聚體,每個(gè)亞單位相對分子質(zhì)量約150 ×103,各含一個(gè)活性中心,每個(gè)活性中心包括四個(gè)活性輔助基團(tuán):Mo,F(xiàn)AD,兩個(gè)Fe/S 叢,XDH 轉(zhuǎn)化成XO 初期發(fā)生巰基氧化反應(yīng),隨后通過巰基反應(yīng)物處理可逆反應(yīng),然后由鈣依賴介導(dǎo)從亞單位分子基團(tuán)裂解成一個(gè)相對分子質(zhì)量約為20 ×103的不可逆反應(yīng)[3]。從尿酸代謝途徑的各個(gè)環(huán)節(jié)分析,XDH/XO 是尿酸生成過多的高尿酸血癥的一個(gè)主要發(fā)病原因。

    圖4 不同物種XDH/XO 基因核苷酸序列比對分析Fig.4 Alignment of XDH/XO gene nucleotide sequence from different species

    圖5 不同物種XDH/XO 基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.5 Phylogenetic tree of XDH/XO gene sequences of different species

    圖6 SWISS-MODEL 模擬XDH/XO 三維結(jié)構(gòu)Fig.6 Three-dimensional structure of XDH/XO simulated with SWISS-MODEL

    圖7 InterProScan 預(yù)測XDH/XO 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig.7 Prediction of the conserved domain of XDH/XO by InterProScan

    本次實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR 的方法對獼猴新鮮肝臟組織的XDH/XO 基因進(jìn)行了體外擴(kuò)增,經(jīng)過RTPCR 擴(kuò)增得到的目的片段顯示其序列共測到683 個(gè)核苷酸,DNAMAN 軟件預(yù)測該段核苷酸的氨基酸序列包括了1 個(gè)編碼53 個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF),通過與NCBI 報(bào)道的人類、小鼠、家鼠、野豬的XDH/XO 基因mRNA 互補(bǔ)的cDNA 核苷酸序列同源性比較分析,結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的目的片段與人類同源性最高,為95.6%。目前國內(nèi)外對獼猴的XDH/XO 基因序列還未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)采用RTPCR 參考人類XDH/XO 基因的CDS 區(qū)設(shè)計(jì)引物,并擴(kuò)增出XDH/XO 基因的cDNA 核苷酸片段。生物信息學(xué)分析采用InterProScan 的結(jié)構(gòu)域功能預(yù)測結(jié)果顯示該段XDH/XO 編碼蛋白含有醛氧化/脫氫酶的鉬喋呤結(jié)合點(diǎn)結(jié)構(gòu)域及黃嘌呤脫氫酶結(jié)構(gòu)域,XDH/XO 為同型二聚體,其2 個(gè)亞單位均有1 個(gè)鉬蝶呤輔因子(molybdopterin,Mo-pt)、2 個(gè)Fe/S 簇、1個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸輔基(FAD),且每個(gè)亞基都可獨(dú)立行使催化功能。在XDH 向XO 轉(zhuǎn)變的過程中,F(xiàn)e/S 中心和Mo-pt 中心均無明顯變化,因此該酶的兩種形式均可催化次黃嘌呤向尿酸的轉(zhuǎn)化,由此推測所擴(kuò)增的該段XDH/XO 基因編碼的蛋白可能為酶活性中心。

    本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步利用獼猴進(jìn)行高尿酸血癥致病機(jī)理研究及抗高尿酸血癥新藥研發(fā)奠定工作基礎(chǔ)。所獲得獼猴XDH/XO 基因?yàn)檫M(jìn)一步研究尿酸相關(guān)調(diào)節(jié)基因的mRNA 水平的定量分析及蛋白表達(dá)變化奠定了一定工作基礎(chǔ)。

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