苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖方法的研究

佟海菊，張志勝，孫克巖，劉亞南

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖方法的研究

佟海菊，張志勝*，孫克巖，劉亞南

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖含量的條件，并對該法的精密度、加標(biāo)回收率等進(jìn)行了研究，得出最佳顯色條件為：苯酚用量1.0mL，濃硫酸用量5.0mL，室溫放置30min，在480nm處測定吸光度。結(jié)果表明，此方法是測定海灣扇貝多糖含量的一種穩(wěn)定性好、回收率高的簡便方法。

苯酚-硫酸法，海灣扇貝多糖，含量測定

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

海灣扇貝粗多糖 本實驗室制得；濃硫酸、重蒸苯酚、無水乙醇、葡萄糖 均為分析純；6%苯酚溶液精密稱取重蒸苯酚3.0g，置50mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻后，置棕色試劑瓶中，冰箱中冷藏儲存?zhèn)溆?；葡萄糖?biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg于250mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻；海灣扇貝多糖溶液 精密稱取海灣扇貝粗多糖，配制成一定濃度的海灣扇貝多糖溶液。

UV-2800型紫外可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最大吸收波長的選擇 分別吸取海灣扇貝多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL，以蒸餾水為空白，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法顯色后，采用UV-2800紫外可見分光光度計進(jìn)行掃描，波長范圍為400～600nm，確定其最大吸收峰所對應(yīng)的波長。

1.2.2 濃硫酸用量實驗 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，加入6%苯酚溶液1mL，搖勻后分別迅速滴加濃硫酸4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL，室溫放置30min，于1.2.1確定的波長測吸光度。

1.2.3 苯酚用量實驗 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，分別加入6%苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，搖勻后迅速滴加由1.2.2確定的濃硫酸，室溫放置30min，于1.2.1確定的波長測定吸光度。

1.2.4 顯色溫度的選擇 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，加入由1.2.2和1.2.3確定的苯酚和濃硫酸，搖勻后分別在室溫、40、60、80℃條件下放置30min，于1.2.1確定的波長測定吸光度。

1.2.5 顯色時間的選擇 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，加入由1.2.2和1.2.3確定的苯酚和濃硫酸，搖勻后在1.2.4確定的溫度下放置20、30、40、50、60min，于1.2.1確定的波長測定吸光度。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[5]精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，搖勻，依據(jù)1.2.1～1.2.5確定的測定條件，以2mL蒸餾水取代葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后作為空白，測定吸光度。

1.2.7 精密度實驗 精密吸取海灣扇貝多糖溶液1mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度，平行測定5次。

1.2.8 穩(wěn)定性實驗 精密吸取海灣扇貝多糖溶液1mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度，連續(xù)3h內(nèi)考查其穩(wěn)定性。

1.2.9 加樣回收率實驗[6]精密吸取海灣扇貝多糖溶液1mL五份，各加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和海灣扇貝多糖溶液顯色后用UV-2800紫外可見分光光度計于400～600nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，兩種溶液均在480nm處有最大吸收，所以選擇480nm為測定波長。

圖1 最佳測定波長的選擇

2.2 硫酸用量實驗

由圖2可知，吸光度隨著濃硫酸用量的增加不斷增大，當(dāng)濃硫酸用量增加到5mL以上時吸光度趨于平緩，所以選擇5mL為最佳濃硫酸用量。濃硫酸加入方式和速度對吸光度有一定的影響，應(yīng)迅速垂直液面加入足夠的濃硫酸。

圖2 不同硫酸用量的吸光度

2.3 苯酚用量實驗

由圖3可知，當(dāng)苯酚用量為1.0mL時，吸光度達(dá)到最高，繼續(xù)增加苯酚用量會使吸光度值下降，所以選擇1.0mL為苯酚最佳用量。

圖3 不同苯酚用量的吸光度

2.4 顯色溫度的選擇

表1 不同顯色溫度下的吸光度

由表1可知，在不同溫度下吸光度的變化不大，可見濃硫酸與水發(fā)生水合作用時放出的熱量可以滿足顯色的要求，因此選擇室溫條件下顯色，室溫顯色還能免去加熱冷卻的環(huán)節(jié)，使操作更簡便。

2.5 顯色時間的選擇

表2 不同顯色時間下的吸光度的影響

由表2可知，在20～60min內(nèi)顯色穩(wěn)定，時間對吸光度的影響不大，但是20min時冷卻不夠完全，選擇30min為最佳顯色時間。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸光度—葡萄糖濃度關(guān)系曲線，其線性回歸方程為y=0.0132x-0.0081，相關(guān)系數(shù)r2為0.9993。結(jié)果表明，葡萄糖在8～36μg/mL范圍內(nèi)其濃度與吸光度線性關(guān)系良好，如圖4所示。

2.7 精密度實驗

海灣扇貝多糖溶液重復(fù)測定5次的RSD值為0.62%（n=5），表明儀器的精密度良好。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 精密度測定結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性實驗

由表4可知，海灣扇貝多糖溶液的RSD為1.22%，表明顯色液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.9 加樣回收率實驗

由表5可知，該實驗方法的平均回收率為100.7%，RSD為1.72%，表明方法的準(zhǔn)確率較高。

3 結(jié)論

苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖含量的最佳波長為480nm。苯酚-硫酸法中，以葡萄糖為對照，顯色的最佳條件為：苯酚加入量為1.0mL，濃硫酸的加入量為5mL，顯色溫度為室溫，顯色時間為30min，多糖含量在8～36μg/mL內(nèi)其濃度與吸光度線性關(guān)系良好?；貧w方程為：y=0.0132x-0.0081，相關(guān)系數(shù)r2為0.9993。該實驗方法的平均回收率為100.7%，RSD為1.72%，顯色液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好，表明該方法是測定海灣扇貝多糖含量的一種穩(wěn)定性好、回收率高的簡便方法。

表5 加樣回收率實驗結(jié)果

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Study on determination of polysaccharides content in argopectens irradias by phenol-sulfuric acid method

TONG Hai-ju,ZHANG Zhi-sheng*,SUN Ke-yan,LIU Ya-nan
（CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China）

To optimize the condition of determining polysaccharides content by phenol-sulfuric acid method， using glucose as the standard sample.The precision and the recovery rate were studied，the better condition was as follows：1.0mL 6%solution of phenol，sulfuric acid 5.0mL，room-temperature for 30min，the absorbency rate was tested in wavelength 480nm.The result showed that the method can be used to determine the argopectens irradias polysaccharides simply and accurately.

phenol-sulfuric acid method；argopectens irradias polysaccharides；content determination

TS207.3

A

1002-0306（2011）10-0447-03

海灣扇貝屬軟體動物門，瓣鰓綱，異柱目，扇貝科，是我國重要的海洋貝類資源。海灣扇貝營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、高度不飽和脂肪酸和微量元素，其中海灣扇貝多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多種生物學(xué)活性功能，可被開發(fā)為理想的保健產(chǎn)品[1-3]。因此，海灣扇貝多糖含量測定方法的研究對于評價海灣扇貝多糖產(chǎn)品的質(zhì)量具有重要的意義。目前，苯酚–硫酸法因其方法簡單、快速，無需多糖純品和高級儀器等優(yōu)點而被廣泛用于測定多糖含量。其原理為多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚生成橙黃色化合物，在波長480～490nm處和一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度與糖濃度呈線性關(guān)系。但苯酚–硫酸法存在平行測定波動性大，重復(fù)性差，不同的含糖物質(zhì)測定條件不同等缺點[4]。苯酚–硫酸法測定海灣扇貝多糖含量的研究尚未見報道，本文以海灣扇貝多糖為原料，研究其顯色條件，并對該方法的精密度、回收率、穩(wěn)定性進(jìn)行考察，得出海灣扇貝多糖含量的最佳測定方法。

2010-11-11 *通訊聯(lián)系人

佟海菊（1984-），女，在讀碩士研究生，主要從事功能食品開發(fā)研究。

國家海洋公益性行業(yè)科研專項（200805046）。