基因芯片在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展

高冬梅

（山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)博士后流動(dòng)站，濟(jì)南250355）

當(dāng)新世紀(jì)曙光升起的時(shí)候，人類基因組測(cè)序工作已接近尾聲，進(jìn)一步了解基因產(chǎn)物及其相互關(guān)系及實(shí)現(xiàn)從基因結(jié)構(gòu)到基因功能跨越的后基因組研究，已成為生命學(xué)科的熱切要求。應(yīng)運(yùn)而生的基因芯片技術(shù)給后基因組研究提供了有力的技術(shù)支持。與此同時(shí)，中醫(yī)界的一些有識(shí)之士也紛紛撰文憧憬著基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥研究的應(yīng)用［1］。中藥品種繁多，如何篩選出有效中藥，進(jìn)而從有效中藥中篩選出有效成分，并快速進(jìn)行中藥毒理學(xué)研究，如何高效、快捷地應(yīng)用于臨床，是中藥藥理研究的重大問(wèn)題。傳統(tǒng)的方法學(xué)對(duì)逐個(gè)單味藥進(jìn)行分析，進(jìn)而對(duì)其不同有效成分（單體）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)多，投入量大，但產(chǎn)出卻很少。相反，如果采取高通量基因芯片篩選方法，快速篩選出有效成分，并快速完成毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，并利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)綜合分析各種成分間相互作用關(guān)系，繪制出中藥復(fù)雜成分間相互作用的可能圖譜，有望大大加快中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，也為中藥產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)保障。

基因芯片又稱DNA微陣列技術(shù)，簡(jiǎn)稱DNA芯片。最早是由E.Southern在1989年提出，是在芯片上按照特定的排列方式，固定上大量探針，形成一種DNA微矩陣，將樣品DNA／RNA擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入標(biāo)記分子后，與位于芯片的探針雜交通過(guò)同位素法、化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法或酶標(biāo)法顯示，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行綜合分析，獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息。該技術(shù)具有高通量和平行檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)就近10年基因芯片在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用與意義闡述如下。

1 基因芯片在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1 在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)，解釋藥物作用機(jī)制將中藥視為組合化學(xué)庫(kù)，篩選其中的有效成分，由此比較基因芯片上基因表達(dá)譜的變化，則有可能開發(fā)作用機(jī)制較明確的新中藥。采用所謂 “譯碼器”策略 （decoder strategy）來(lái)確定藥物靶標(biāo)，從而找到 “導(dǎo)向藥物”或“特效藥”。當(dāng)然，從中藥及其復(fù)方中篩選離子通道特異性調(diào)節(jié)劑、蛋白激酶抑制物或激活劑、細(xì)菌或腫瘤組織的耐藥性抑制劑等，都可采用基因或蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，將中藥及其復(fù)方直接作用于基因組或蛋白組，觀察特定基因表達(dá)或蛋白質(zhì)構(gòu)象或活性。傳統(tǒng)的膜片鉗或受體藥理方法發(fā)現(xiàn)，川芎嗪、粉防己甲素具有鈣通道拮抗劑作用，這種研究是復(fù)雜的。如果采用基因芯片，從人類基因庫(kù)中提取所有離子通道基因，采用芯片技術(shù)，在不同基因及其表達(dá)的蛋白上加上中藥，觀察中藥對(duì)基因表達(dá)或蛋白構(gòu)象變化的影響，從而迅速了解此藥物的可能作用機(jī)制［2］。托婭等［3］利用基因芯片技術(shù)，從基因水平解釋抗腫瘤血管生成中草藥的有效組分T3d的分子機(jī)制，采用人胃癌BGC823細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞 （EC），結(jié)果BGC823細(xì)胞組有2.53%基因表達(dá)譜發(fā)生明顯的變化，其中158條基因在經(jīng)過(guò)T3刺激后表達(dá)量明顯上升，44條明顯下降。EC組有0.456%的基因表達(dá)譜發(fā)生明顯的變化，其中30條基因在經(jīng)過(guò)T3刺激后表達(dá)量明顯上升，7條明顯下降。因此利用基因芯片技術(shù)可以從基因水平解釋中藥的作用機(jī)制［4－8］，為新藥的開發(fā)提供依據(jù)。

在新藥開發(fā)中，高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設(shè)計(jì)。噬菌體展示技術(shù)可創(chuàng)造大量蛋白質(zhì)，目前多用于抗體庫(kù)的建立和篩選，進(jìn)而可用于受體－配體相互作用的研究。基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué) （bioinformatics）將大大促進(jìn)制藥工業(yè)的發(fā)展。目前第一個(gè)生物分子工程藥物Herceptin已用于乳癌的治療，并獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)。除腫瘤外，用分子生物工程設(shè)計(jì)的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病，延緩衰老，也可用分子生物工程技術(shù)設(shè)計(jì)新的抗生素和工業(yè)用酶等。同時(shí)，一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新功能。原先設(shè)想的作用是針對(duì)某一靶標(biāo)的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥在另一方面有很強(qiáng)的抑制作用，從而為開發(fā)成另一種新藥開辟新途徑。

1.2 鑒定藥物的潛在效應(yīng) 基因芯片在用來(lái)研究藥物的作用機(jī)制時(shí)十分有用。Matron［9］等人利用基因芯片構(gòu)建了免疫抑制性藥物FK506處理酵母細(xì)胞后的基因表達(dá)圖譜。發(fā)現(xiàn)用FK506處理的酵母細(xì)胞基因表達(dá)圖譜與FK506靶標(biāo)的無(wú)意義突變體相似；而用FK506去處理此突變體，發(fā)現(xiàn)了不同于野生型的作用機(jī)制。Clarke等［10］應(yīng)用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C和5－氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶－DNA糖基酶的基因表達(dá)增加。該研究提示，這類研究既有助于闡明藥物的作用機(jī)制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。通過(guò)這種方法能有效地篩選出有效中藥及其有效成分。

1.3 用于芯片毒理學(xué)研究 應(yīng)用芯片查找藥物的毒性或不良反應(yīng)，進(jìn)行毒理學(xué)研究。尤其是慢性毒性和不良反應(yīng)，普通的藥理學(xué)方法耗時(shí)長(zhǎng)，需要的人力和物力多，而且還有可能遺漏某些可能存在的潛在毒性和不良反應(yīng)。而在基因水平進(jìn)行分析，觀察中藥對(duì)人體一些看家基因（house－keeping gene）成分是否具有影響，如細(xì)胞骨架基因、組蛋白基因等，便能徹底了解該中藥的可能毒性和不良反應(yīng)。如果該藥能抑制重要基因的表達(dá)，則對(duì)它的深入研究就值得考慮。如果中藥中某種成分具有這種作用，那么對(duì)它進(jìn)行改造時(shí)，就應(yīng)該去除該成分，以便取長(zhǎng)補(bǔ)短。目前國(guó)內(nèi)尚未正式進(jìn)行基因芯片的藥理學(xué)研究，但中藥藥理學(xué)研究可以借鑒西藥藥理研究方法，從而給中藥藥理研究帶來(lái)啟示。

在國(guó)外，利用芯片進(jìn)行藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)已相當(dāng)普及。Nuwaysir等［11］研制了包括涉及細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、氧化應(yīng)激或氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、過(guò)氧化物酶體增殖反應(yīng)、二惡英或多環(huán)芳烴反應(yīng)、雌激素反應(yīng)、看家基因、癌基因和抑癌基因、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細(xì)胞色素P450等共2090個(gè)基因的毒理芯片 （Tox Chip v1.0），該芯片既可用于毒物的檢測(cè)和遺傳多態(tài)性的檢測(cè)，又可用于受檢毒物的毒性作用機(jī)制研究。2000年，牛津大學(xué)的Pennie等［12］構(gòu)建了ToxBlot芯片，并對(duì)基因芯片技術(shù)應(yīng)用于毒性機(jī)制和毒性預(yù)測(cè)進(jìn)行了研究。ToxBlot芯片能夠完成有關(guān)內(nèi)分泌的破壞、肝細(xì)胞毒性和胰島素敏感化合物骨髓毒性的研究。最近，Holden等從人和小鼠文庫(kù)中選擇約600個(gè)與毒理學(xué)相關(guān)基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的病理基因組學(xué)芯片，可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點(diǎn)的作用機(jī)制，也可用于確定以基因表達(dá)模式為基礎(chǔ)的化合物的毒性。此技術(shù)應(yīng)用于毒理研究目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，但可以預(yù)見(jiàn)，如中藥藥理學(xué)研究引入基因芯片技術(shù)，將大大推動(dòng)中藥研究的國(guó)際化進(jìn)程，對(duì)闡明中藥作用機(jī)制，具有無(wú)可估量的重要意義。

1.4 有效中藥和中藥有效成分的大規(guī)模篩選 中藥的有效成分十分復(fù)雜，傳統(tǒng)的藥理研究方法周期長(zhǎng)，耗時(shí)多，所需財(cái)力大，而采用基因芯片研究，將數(shù)千種不同中藥或中藥不同成分作用于一定的培養(yǎng)細(xì)胞后，甚至是人體的克隆細(xì)胞，觀察它們對(duì)基因表達(dá)的影響，從而能從基因組水平了解它們的作用機(jī)制與作用范圍，大大加快有效中藥和中藥有效成分的大規(guī)模篩選過(guò)程。另外，對(duì)新發(fā)現(xiàn)的中草藥的功能鑒定也起到一定的作用。目前，這種用于藥材鑒別的基因芯片仍處在研究階段，已有人對(duì)貝母進(jìn)行特異性序列和鑒別芯片的實(shí)驗(yàn)研究，相信不久的將來(lái)基因芯片就會(huì)廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域［13］。

1.5 中藥復(fù)方研究 中藥復(fù)方成分復(fù)雜，傳統(tǒng)方法是將其中的中藥進(jìn)行不同組合，進(jìn)行 “拆方”、“組方”，從而推出復(fù)方的可能作用機(jī)理，而且其作用僅限于研究的某一方面或幾方面作用，很難對(duì)該復(fù)方有全面的認(rèn)識(shí)，尤其是對(duì)新功能的認(rèn)識(shí)和開發(fā)。而采用基因芯片技術(shù)，能迅速了解該復(fù)方對(duì)基因組中某些基因表達(dá)的影響，從而不僅了解該復(fù)方的原有功能，還有可能很輕易地發(fā)現(xiàn)該復(fù)方組方后可能出現(xiàn)的新功能，為復(fù)方的新功能開發(fā)提供了客觀依據(jù)［2］。

2 存在問(wèn)題及展望

2.1 存在問(wèn)題：①由于人類基因組測(cè)序尚未完成，許多基因還不明朗，因此，基因芯片由于所含基因數(shù)不全，以致大量的可能有變化的基因漏網(wǎng)，而明顯影響到研究結(jié)果。正由于如此，在目的類似的DDPCR實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)許多新的基因片段。②以動(dòng)物模型為工具進(jìn)行各項(xiàng)研究，由于此動(dòng)物 （小鼠、大鼠等）的基因測(cè)序工作還沒(méi)有大面積展開，需要更晚些時(shí)候才能完成。③由于哺乳類動(dòng)物基因組數(shù)量大，測(cè)同一細(xì)胞組織，就目前的基因芯片規(guī)模，整個(gè)基因組需要許多塊芯片，研究工作量和研究成本會(huì)很高而且研究費(fèi)用高昂。④實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大，且大量的基因功能還不明朗，因此給進(jìn)一步研究帶來(lái)困難。⑤基因芯片技術(shù)本身存在假陽(yáng)性率偏高，較嚴(yán)重影響臨床應(yīng)用價(jià)值；其次是首先要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，增加操作復(fù)雜性［14］。

2.2 發(fā)展前景 雖然有問(wèn)題存在，但基因芯片技術(shù)為生命科學(xué)展現(xiàn)出絢麗的前景：①隨著人類、大鼠、小鼠，甚至兔、狗、猴等基因組測(cè)序完成，將有可能生產(chǎn)出全套基因組芯片，使基因芯片在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用。②當(dāng)基因芯片生產(chǎn)技術(shù)趨于成熟，可能會(huì)大批量生產(chǎn)，將有可能降低生產(chǎn)成本，降低售價(jià)，易于普及。③一旦類似高效的蛋白芯片技術(shù)的解決，與基因芯片的配套使用，將會(huì)對(duì)生命科學(xué)研究取得質(zhì)的突破。④多學(xué)科交叉，各項(xiàng)技術(shù)向縱深。例如計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，讀片分析自動(dòng)化程度增加，將使基因芯片技術(shù)更加完善、實(shí)用。⑤不同基因功能研究的積累，以及基因功能研究技術(shù)的發(fā)展與普及，使基因芯片研究的后續(xù)工作得以有效地開展，基因芯片的科學(xué)價(jià)值即實(shí)用價(jià)值將得到充分的體現(xiàn)和迅速發(fā)展［1］。

［1］方肇勤.基因芯片技術(shù)及其在中醫(yī)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，1（15）：17－19.

［2］張發(fā)寶，李欣梅.基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，3（21）：57－59.

［3］托婭，蘇秀蘭.基因芯片在抗腫瘤血管生成中草藥相關(guān)基因篩選中的研究［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23（3）：273－275.

［4］王興，任敏.糖腎平膠囊對(duì)糖尿病小鼠大血管基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)天然藥物，2005，1（3）：53－55.

［5］王波，李玉.明胰島素抵抗高血壓大鼠基因表達(dá)譜和糖脂消對(duì)其的影響［J］.介入放射學(xué)雜志，2004，12（2）：205－212.

［6］Wu Yu，Yang Yu－fei，Dong－Hua.Microarray gene chip analysis and action of yiyiren oil on anti－tumor metastasis reactive gene［J］.Chinese Journal Clinical Rehabilitation，2005，22（9）：265－269.

［7］張小燕，張占軍，王忠.梔子苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織基因表達(dá)譜的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，1（25）：42－44.

［8］王米渠，許景文.中醫(yī)研究與基因組學(xué)及基因芯片技術(shù)［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，3（14）：62－64.

［9］Matron MJ，Derisive JL，Bennett HA.Drug target validation and identification of secondary drug target effect using DNA microarray［J］.Nature Medicine，1998，4：1293－1301.

［10］Clarke PA，George M，Cunningham D.Analysis of tumor gene expression following chemotherapeutics of patients with bowel cancer［J／OL］［J］.Nat Am Inc.1999.

［11］Nuwaysir EF，Bittner M，Trent J.Microarrays and toxicology：The advent of toxicogenomics［J］.Mol Carcinog，1999，24（3）：153－159.

［12］Pennie Wd.The priciples and practices of toxicogenomics：application and opportunities［J］.Toxicol Sci，2000，4（2）：227.

［13］楊光明，蔡寶昌.分子生物下學(xué)技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用［J］.世界科學(xué)技術(shù)－中藥現(xiàn)代化，2001，4（3）：29－37.

［14］成軍.基因芯片技術(shù)的原理及其在肝病研究中的應(yīng)用［J］.中華肝病雜志，2002，4（8）：302.