黃芩毛狀根中總黃酮的提取工藝

施春陽， 齊香君， 錢衛(wèi)東， 徐方穩(wěn)， 郝紅梅

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西三正藥業(yè)有限公司， 陜西 咸陽 712000； 3.陜西康惠制藥股份有限公司， 陜西 咸陽 712000)

0 引言

中藥黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效[1]，臨床應(yīng)用廣泛.近年來，因黃芩藥材資源的長期過度開發(fā)和破壞，出現(xiàn)了資源緊缺、供不應(yīng)求的問題.總黃酮是黃芩的主要藥用成分，其主要有效成分黃芩苷和黃芩素具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用[2-4].相關(guān)研究表明[5,6]，黃芩毛狀根組織培養(yǎng)能有效積累黃芩苷和黃芩素等黃酮類物質(zhì)，特別是黃芩苷的含量甚至超過了傳統(tǒng)中藥材.本文以黃芩毛狀根為材料，研究了利用大孔吸附樹脂從中提取總黃酮的工藝，從而為黃芩藥用成分的提取和資源開發(fā)開辟了一條新的途徑.

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

黃芩毛狀根干品：黃芩毛狀根經(jīng)改良的1/2 MS液體培養(yǎng)基通氣暗培養(yǎng)50 d，取出，70 ℃烘干.黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，110715-201016)，各種樹脂(西安藍曉科技有限公司)，其他試劑為分析純.

UV-9100紫外可見分光光度計，北京瑞利；6100A植物罐，上海高機生物；AJ5800電子輸液泵，上海安潔電子；PHS-3C 酸度計，上海精科.

1.2 黃芩毛狀根總黃酮上樣液的制備

取80.00 g黃芩毛狀根干品，分別加10倍量和8倍量水煎煮二次，每次1.5 h，合并濾液，濃縮至原體積的1/2，用HCl調(diào)pH 至4.0，冷藏過夜，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液并用水定容至1 000 mL[7].經(jīng)測定，上樣液中總黃酮含量為11.30 mg·mL-1.

1.3 總黃酮含量的測定

1.3.1 黃芩苷標準曲線的制作

取105 ℃恒重的黃芩苷對照品0.014 4 g，甲醇溶解并定容至100 mL，得135.36μg·mL-1黃芩苷標準液.分別取上述標準液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL于25 mL容量瓶，水定容后在274 nm下測定吸光值A(chǔ)[8].以A對黃芩苷濃度作標準曲線，計算標準曲線的回歸方程.

1.3.2 樣品液中總黃酮含量的測定

取待測樣品液，稀釋適當倍數(shù)，按“1.3.1”項的方法測定吸光值A(chǔ).由公式1計算樣品液的總黃酮含量.

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其中：A— 吸光值；n— 稀釋倍數(shù).

1.4 總黃酮提取工藝的考察

根據(jù)總黃酮含量測定結(jié)果，以總黃酮吸附量、解吸率和回收率為指標，優(yōu)選樹脂型號，并考察不同上樣和洗脫條件對總黃酮提取效果的影響，并繪制所選樹脂的泄漏曲線和洗脫曲線，確定最佳提取工藝，最后考察該工藝的穩(wěn)定性和樹脂的重復(fù)使用次數(shù).總黃酮解吸率和回收率分別按公式2和3計算.

(2)

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2 結(jié)果與討論

2.1 黃芩苷標準曲線方程

經(jīng)測定，黃芩苷含量測定的標準曲線方程為：Y=0.055 4X+0.002，r=0.999 9，說明在2.7～16.2μg·mL-1范圍內(nèi)黃芩苷的線性關(guān)系良好.

2.2 樹脂型號的確定

取各種型號樹脂1.00 g，加15 mL含總黃酮11.30 mg·mL-1的上樣液，于搖床中100 r·min-1振搖吸附24 h，測定上樣液中殘余總黃酮的濃度，計算每克濕樹脂的總黃酮吸附量；用去離子水洗樹脂數(shù)次，加95%乙醇150 mL，振搖解吸附24 h，測定解吸液中總黃酮的濃度，由公式2計算解吸率，結(jié)果見表1.

表1 樹脂型號的確定

由表1可知，綜合考慮各種樹脂的總黃酮吸附量和解吸率，LX-22大孔吸附樹脂對黃芩毛狀根總黃酮的提取效果最佳.

2.3 上樣工藝的考察

2.3.1 上樣液濃度對總黃酮吸附性能的影響

以相同流速將濃度分別為1.79、3.90、6.28、8.69和11.30 mg·mL-1的上樣液通過LX-22樹脂柱，動態(tài)吸附至流出液經(jīng)2%氯化鐵檢查呈陽性，去離子水洗樹脂柱至水洗液檢查呈陰性，測定流出液和水洗液的總黃酮濃度，計算每克濕樹脂的總黃酮吸附量[9]，結(jié)果見圖1.由圖1可以看出，上樣液濃度在8.69 mg·mL-1時，LX-22大孔吸附樹脂對總黃酮的吸附量最高.

圖1 上樣液濃度對總黃酮吸附性能的影響

2.3.2 上樣速度對總黃酮吸附性能的影響

將濃度為8.69 mg·mL-1的上樣液分別以相當于濕樹脂重量2、4、6和8 BV·h-1的流速通過LX-22樹脂柱，按“2.3.1”方法操作，計算每克濕樹脂的總黃酮吸附量.再用95%乙醇進行洗脫，測定洗脫液中總黃酮含量，由公式3計算總黃酮的回收率，結(jié)果見表2.

表2 上樣速度對總黃酮吸附性能的影響

由表2可知，綜合考慮總黃酮的吸附量和回收率，上樣速度在6 BV·h-1時，LX-22大孔吸附樹脂對總黃酮的提取效果最好.

2.3.3 樹脂柱徑高比對總黃酮吸附性能的影響

將8.69 mg·mL-1上樣液以6 BV·h-1流速通過徑高比分別為1∶8、1∶14和1∶20的LX-22樹脂柱，其余操作同“2.3.2”，計算總黃酮的吸附量和回收率，結(jié)果見表3.

表3 樹脂柱徑高比對總黃酮吸附性能的影響

由表3可知，綜合考慮總黃酮的吸附量和回收率，樹脂柱徑高比為1∶14時，LX-22大孔吸附樹脂對總黃酮的提取效果最好.

2.3.4 泄漏曲線的考察

按上述確定的最佳吸附條件將上樣液通過LX-22樹脂柱，分段收集流出液，每份50 mL，測定每份流出液中總黃酮濃度，直至樹脂飽和，繪制泄漏曲線[10]，見圖2.

圖2 泄漏曲線

如圖2所示，當上樣液體積為濕樹脂重量的13 BV時，流出液中總黃酮濃度突然增大，說明上樣液總黃酮開始明顯泄漏，此時LX-22大孔吸附樹脂對總黃酮的吸附量約為113.0 mg·g-1.

2.4 洗脫工藝的考察

2.4.1 洗脫劑濃度對解吸性能的影響

按上述確定的最佳吸附條件使LX-22大孔吸附樹脂柱吸附總黃酮至飽和，用去離子水洗至流出液經(jīng)2%氯化鐵檢查呈陰性，再用不同濃度的乙醇進行洗脫，以考察不同濃度乙醇的洗脫效果，結(jié)果見表4.

表4 洗脫劑濃度對解吸性能的影響

由表4可知，綜合考察總黃酮的解吸率和回收率，70%乙醇最適合LX-22大孔吸附樹脂中總黃酮的洗脫.

2.4.2 洗脫速度對解吸性能的影響

按確定的最佳吸附條件使LX-22大孔吸附樹脂柱吸附總黃酮至飽和，用去離子水洗至流出液經(jīng)2%氯化鐵檢查呈陰性，再用70%乙醇分別以相當濕樹脂重量4、6、8和10 BV·h-1的流速洗脫，結(jié)果見表5.

表5 洗脫速度對解吸性能的影響

由表5可知，洗脫速度在4和6 BV·h-1時效果均較好，為加快洗脫速度，提高總黃酮提取效率，選擇最佳洗脫速度為6 BV·h-1.

2.4.3 洗脫曲線的考察

上樣液按照確定的最佳工藝進行上柱、吸附和洗脫，分段收集洗脫液，測定每份洗脫液總黃酮濃度，繪制洗脫曲線，見圖3.由圖3可以看出，洗脫劑用量為3 BV時，洗脫液中總黃酮含量達50 mg·mL-1以上，隨后快速下降，當洗至用量為相當于濕樹脂重量的9 BV時，已能將總黃酮基本解吸完全.

圖3 洗脫曲線

2.5 驗證實驗

稱預(yù)處理好的LX-22樹脂5.00 g共3份，按上述最優(yōu)條件進行裝柱、上樣吸附和洗脫，計算樹脂對黃芩毛狀根總黃酮的吸附量和總黃酮的回收率，驗證工藝穩(wěn)定性[11]，結(jié)果見表6.

表6 驗證實驗結(jié)果

如表6所示，在試驗確定的提取工藝條件下，LX-22大孔吸附樹脂對黃芩毛狀根中總黃酮的平均吸附量和總黃酮回收率分別達113.6 mg·g-1和82.6%，說明本工藝的提取效果穩(wěn)定.

2.6 樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察

按最佳工藝條件在同一LX-22樹脂柱上重復(fù)進行上樣、水洗和洗脫數(shù)次，分別計算總黃酮吸附量，確定樹脂的重復(fù)使用次數(shù)[12].結(jié)果表明樹脂重復(fù)使用第二和第三次時，總黃酮吸附量分別降至第一次的81.3%和49.6%，樹脂由白色變?yōu)榛尹S色.綜合考慮樹脂的生產(chǎn)成本和提取效果，建議重復(fù)使用2～3次需用95%乙醇進行再生處理.

3 結(jié)論

采用LX-22大孔吸附樹脂從黃芩毛狀根中提取總黃酮的工藝條件為：濃度為8.69 mg·mL-1上樣液，以相當于濕樹脂重量6 BV·h-1的流速通過徑高比為1∶14的樹脂柱，上樣體積為13 BV，用去離子水洗樹脂柱至流出液經(jīng)2%氯化鐵檢驗呈陰性，以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為6 BV·h-1、洗脫劑用量為9 BV，將洗脫液濃縮結(jié)晶，即得黃芩毛狀根總黃酮.在所確定的優(yōu)化工藝條件下，LX-22大孔吸附樹脂可有效地提取黃芩毛狀根中的總黃酮，樹脂對總黃酮的吸附量達113 mg·g-1，總黃酮的回收率超過82%.

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