羥丙基殼聚糖-胰島素微球的制備及性能

來水利, 高瑩華, 王克玲, 肖雨晨

(1.陜西科技大學(xué) 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710021； 2.鄭州市商業(yè)技師學(xué)院，河南 鄭州 450121 )

0 引言

殼聚糖(CS)是天然多糖中唯一的堿性多糖，含有游離的一級(jí)氨基，可通過體內(nèi)的溶菌酶作用分解為葡胺糖，被人體吸收.因其來源豐富、無毒、有優(yōu)良的生物相容性和減緩藥物擴(kuò)散和溶出等特性[1-3]，可以很好地用于藥物載體[4-6].但是CS的水溶性較差，只能溶于弱酸，這會(huì)限制CS的應(yīng)用范圍，影響微球的制備和藥物釋放.所以在不改變其堿性和正電性的情況下，將其羥丙基化，制備水溶性的羥丙基殼聚糖(HPCS)，即可解決殼聚糖水溶性較差的問題[7].本文通過CS與環(huán)氧丙烷反應(yīng)制備HPCS，并將其用于載胰島素微球的載藥材料，研究了微球的結(jié)構(gòu)和性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

殼聚糖(CS)：青島海匯生物有限公司生產(chǎn)；異丙醇：分析純，濟(jì)南試劑總廠；丙酮：分析純，齊魯石化公司研究院試劑廠；環(huán)氧丙烷：化學(xué)純，上海試劑一廠.

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；Spectrum100型紅外吸收光譜儀：美國Perkin Elmer公司；HITACHI S-570型掃描電子顯微鏡：日本日立公司；DX-2500型X-射線衍射儀：丹東方圓儀器有限公司.

1.2 羥丙基殼聚糖制備方法

稱取25 g CS分散于60 mLw(NaOH)=40%的水溶液中，攪勻后放置3 h，使其充分溶脹，放入冰箱冷凍7 d后，室溫解凍，加入三口燒瓶中，添加100 mL異丙醇，室溫下攪拌反應(yīng)1 h.再滴加環(huán)氧丙烷，使n(CS)∶n(環(huán)氧丙烷) =1∶12～16，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，然后升溫至40～45 ℃，再反應(yīng)8 h后，冷卻，離心分出不溶物.用異丙醇反復(fù)洗滌不容物，再取少量水溶解，用1∶1(v/v)的鹽酸中和至pH≈7，將溶液裝入透析袋中，自來水透析1 d，換去離子水透析3 d.透析液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，以丙酮沉淀，并離心分出，于60 ℃真空干燥得羥丙基殼聚糖(HPCS).

1.3 羥丙基殼聚糖-胰島素微球的制備

采用單凝聚法[8]制備：取60 mL液體石蠟，加入適量乳化劑，室溫?cái)嚢? h，作為連續(xù)相.再將HPCS水溶液與一定量的胰島素混合均勻，滴入攪拌中的連續(xù)相，滴完后室溫反應(yīng)一定時(shí)間，然后加入一定量的交聯(lián)劑戊二醛，交聯(lián)反應(yīng)2 h.反應(yīng)液低速離心，沉淀用石油醚洗滌兩到三次，真空干燥48 h，得到HPCS-胰島素微球.同法，不加胰島素制備空白微球.

1.4 羥丙基殼聚糖-胰島素微球包埋率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]中，分別稱取兩份空白微球和一份胰島素微球，制備空白液、標(biāo)準(zhǔn)液(HPCS微球+胰島素)和樣品液.將上述三種溶液加熱回流2 h，使微球全部降解.以空白液做參比，將空白液和標(biāo)準(zhǔn)液按不同的體積混合配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外分光光度計(jì)276 nm下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品液的胰島素含量.根據(jù)以下公式計(jì)算包埋率：

EE=M1/M2×100%

(1)

式中：EE為微球包埋率,M1為實(shí)際測(cè)得的胰島素含量,M2為試驗(yàn)中所加胰島素量.

2 結(jié)果與討論

2.1 微球制備條件的確定

2.1.1 攪拌速度對(duì)包埋率的影響

當(dāng)轉(zhuǎn)速過慢，不能使藥物和載藥材料均勻分散，微球成塊狀，有粘結(jié)現(xiàn)象，導(dǎo)致藥物不能包埋在微球內(nèi)部，包埋率很低；轉(zhuǎn)速過快，剪切力過大，容易破壞微球的交聯(lián)或發(fā)生空化作用，使得微球形態(tài)不均勻，使微球的收率降低，包埋率也降低.如圖1所示，攪拌速度為400 r/min時(shí)包埋率較高，為較佳攪拌速度.

圖1 攪拌轉(zhuǎn)速的影響

2.1.2 HPCS用量對(duì)包埋率的影響

如圖2所示，當(dāng)HPCS加入量較小時(shí)，制得的微球強(qiáng)度較差，易粘結(jié)在一起，包埋率很低；當(dāng)HPCS加入量較大時(shí)，粘度較大，難分散，包埋率也下降.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HPCS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(HPCS)=8%時(shí)，微球形態(tài)較好，粒徑較小，包埋率最高，為制備微球的最佳用量.

圖2 HPCS用量的影響

2.1.3 交聯(lián)劑用量的影響

戊二醛的醛基與HPCS中2位氨基之間發(fā)生醛氨縮合反應(yīng)，進(jìn)行交聯(lián)，固化成囊，形成致密的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使藥物被包裹在囊心，阻滯藥物向外擴(kuò)散[10]，但用量太少，將不能對(duì)微球有效的固化，微球?qū)⒊拾牍腆w狀態(tài)，其中的藥物易流出；用量太多，微球變?yōu)楹稚蚝谏?，這使HPCS變質(zhì)，甚至?xí)顾幬锇l(fā)生交聯(lián)反應(yīng)破壞藥物的活性.如圖3所示，當(dāng)交聯(lián)劑戊二醛的體積分?jǐn)?shù)φ=0.25%(對(duì)液體石蠟)時(shí)，包埋率最高，可達(dá)到63%.

圖3 交聯(lián)劑用量的影響

2.2 HPCS-胰島素微球的結(jié)構(gòu)表征及性能分析

2.2.1 微球的紅外光譜

如圖4所示，在HPCS的譜圖上，3 440 cm-1處為較強(qiáng)的O-H和N-H伸縮振動(dòng)吸收峰的疊加，而b、c此處的吸收峰都加寬，并且發(fā)生了不同程度的移動(dòng)，說明HPCS的N-H與戊二醛發(fā)生了醛氨縮合反應(yīng)，產(chǎn)生 N=C鍵，使N-H鍵消失.在HPCS的譜圖上，2 970 cm-1和1 460 cm-1處出現(xiàn)了極為明顯的吸收峰，這兩處分別是-CH的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)，說明在殼聚糖上引入了羥丙基基團(tuán)，羥丙基取代后引入了大量的甲基，b、c在此處的峰更加明顯，說明交聯(lián)劑戊二醛引入了C-H鍵.

圖4 微球的紅外譜圖

2.2.2 微球的XRD譜圖

如圖5所示，HPCS由于在CS上引入了羥丙基后破壞了CS的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷ЫY(jié)構(gòu)；HPCS空白微球和HPCS-胰島素微球均無明顯的衍射峰，屬于非晶結(jié)構(gòu)，可能HPCS和胰島素這兩種大分子并沒有發(fā)生化學(xué)結(jié)合.

圖5 微球的XRD譜圖

2.2.3 微球的熱穩(wěn)定性分析

如圖6所示，HPCS在248 ℃出現(xiàn)吸熱分解峰，而HPCS空白微球的吸熱分解峰出現(xiàn)在312 ℃，提高了64 ℃，可能是交聯(lián)固化作用使HPCS的熱分解溫度提高.HPCS-胰島素微球在309 ℃處出現(xiàn)了胰島素的二級(jí)構(gòu)型轉(zhuǎn)變放熱峰，抵消了此溫度附近的熱分解峰，可知HPCS-胰島素微球的熱分解溫度沒有明顯提高.

圖6 微球的DSC譜圖

2.2.4 微球外貌及粒徑分析

圖7 微球的粒徑分布圖

2.2.5 微球的外貌觀察

如圖8所示，載藥微球明顯大于空白微球，微球的表面結(jié)構(gòu)密實(shí)，分散性較好；空白微球表層有稍微突起的棱角，可能是因?yàn)榭瞻孜⑶騼?nèi)部有空隙，從溶液中離心分出的過程中相互擠壓形成的.

圖8 微球的掃描電鏡照片

3 結(jié)束語

(1)HPCS-胰島素微球制備的較佳制備條件為：攪拌速度為400 r/min，HPCS的用量為w(HPCS)=8%，交聯(lián)劑戊二醛的體積分?jǐn)?shù)φ=0.25%(對(duì)液體石蠟).

(2)采用HPCS包覆胰島素制備的微球，形態(tài)規(guī)整，表面密實(shí)，分散性較好.其粒徑較小且分布較窄，微球的平均粒徑為13.34μm，包埋率較高，最高可達(dá)63%.

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