生物芯片檢驗(yàn)技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用

【作者】張志軍，許偉

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，北京市，100044

醫(yī)學(xué)診斷通常需要多個(gè)個(gè)體樣品和每個(gè)樣品的多指標(biāo)同時(shí)檢驗(yàn)，但目前的生化檢驗(yàn)，多為單樣品、單指標(biāo)，存在需要樣品量大和檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。探索高通量檢驗(yàn)技術(shù)是醫(yī)學(xué)診斷的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。生物芯片技術(shù)是指通過(guò)微加工和微電子技術(shù)在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物分子進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高能量檢測(cè)的技術(shù)。這一技術(shù)的發(fā)展可起源于一個(gè)多世紀(jì)前，當(dāng)時(shí)Ed.Southern建立了以其名字命名的Southern印跡技術(shù)，這被人們視為人類第一個(gè)“生物芯片”。此后，20世紀(jì)80年代初雜交測(cè)序概念的提出，W.Bains等人借助雜交方式對(duì)固定到支持物上的小DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定的工作都為生物芯片的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)；之后為適應(yīng)“后基因時(shí)代”的到來(lái)，90年代，生物科學(xué)技術(shù)產(chǎn)生了以基因芯片為先導(dǎo)的生物芯片技術(shù)[1]，這使得生物芯片技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)全新的技術(shù)時(shí)代。目前生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室、細(xì)胞芯片、組織芯片、糖芯片、電子芯片、流過(guò)式芯片、三維芯片、光纖芯片和聚毗咯膜芯片等[2-3]多種生物芯片技術(shù)。

1 基因芯片

基因芯片是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟且最先進(jìn)入應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)商品化的技術(shù)，它的兩個(gè)主要分支技術(shù)——寡核苷酸芯片技術(shù)與DNA微陣列技術(shù)分別于20世紀(jì)90年代先后問(wèn)世。這一技術(shù)在短短十多年的發(fā)展進(jìn)程中不僅加速了生物科學(xué)的發(fā)展同時(shí)自身也得到了飛速提高。這一技術(shù)是基于核酸互補(bǔ)雜交原理研制而成的一種使待分析樣品通過(guò)與芯片中已知堿基順序的DNA片段互補(bǔ)雜交，從而確定樣品中的核酸序列和性質(zhì)，并對(duì)基因表達(dá)的量及其特性進(jìn)行分析的技術(shù)?；蛐酒鶕?jù)功能的不同可分為基因表達(dá)譜芯片和DNA測(cè)序芯片，根據(jù)基因芯片所用基因探針的不同可分為cDNA微陣列芯片和寡核苷酸陣列芯片兩類，根據(jù)固相支持物的不同可分為無(wú)機(jī)（玻璃、硅片等）芯片與有機(jī)（聚丙烯膜、硝酸纖維素膜等）芯片，根據(jù)點(diǎn)樣方式不同可分為原位合成芯片、微矩陣芯片（分噴點(diǎn)和針點(diǎn)）和電定位芯片，根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域的不同又可將其分為各種專用型芯片，如表達(dá)譜芯片、病毒芯片等。

基因芯片技術(shù)革新主要包括芯片微陣列制備、樣品制備、生物分子反應(yīng)及信號(hào)的檢測(cè)與分析這4個(gè)環(huán)節(jié)?；蛐酒膬?yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在快速準(zhǔn)確、微型化、自動(dòng)化、多功能這四個(gè)方面[4]。該技術(shù)主要應(yīng)用于基因差異表達(dá)分析和基因鑒定，DNA測(cè)序、基因突變及多態(tài)性掃描，腫瘤的發(fā)生、分型與診斷，基因組的比較及細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)等的多項(xiàng)研究中。

2 蛋白芯片

20世紀(jì)80年代，Ekin和Chu為檢測(cè)多種蛋白的表達(dá)首先提出了以抗體為基礎(chǔ)的“微陣列”概念，并證實(shí)了基于抗體微陣列的技術(shù)可以同時(shí)高度敏感的檢測(cè)多種蛋白質(zhì)。1994年澳大利亞Wilkin和Williams提出了“蛋白質(zhì)組”的概念，它與90年代中期發(fā)展起來(lái)的生物芯片相結(jié)合后即產(chǎn)生了新的生物研究技術(shù)——蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。這一技術(shù)雖只有十多年的發(fā)展歷程，但其已在蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白質(zhì)與小分子相互作用等多個(gè)研究領(lǐng)域發(fā)揮出了巨大的作用。蛋白質(zhì)芯片又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，它是將大量的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑或檢測(cè)探針以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在玻片、硅片及纖維膜等固定載體上組成密集的陣列，能夠高通量地測(cè)定蛋白質(zhì)的生物活性，蛋白質(zhì)與大分子和小分子的相互作用，或者用于高通量定性和定量檢測(cè)蛋白質(zhì)[5]。它與基因芯片的不同之處在于芯片上固定的分子是蛋白質(zhì)抗原/蛋白質(zhì)抗體，其檢測(cè)原理是蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用[10]。

目前對(duì)蛋白質(zhì)芯片的分類可根據(jù)結(jié)合反應(yīng)的不同將其分為化學(xué)芯片與生物芯片[6]。化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)想來(lái)源于經(jīng)典色譜法（反相層析、離子交換層析、金屬螯合層析等）。鋪有相關(guān)介質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片可以通過(guò)介質(zhì)的疏水力、靜電力、共價(jià)鍵等結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)，用洗脫液去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)，而保留感興趣的蛋白質(zhì)。生物型蛋白質(zhì)芯片則是將生物活性分子（如：抗體、抗原、受體或配體等）結(jié)合到芯片表面，用于捕獲靶蛋白。根據(jù)載體的不同[7-8]，將蛋白質(zhì)芯片分為普通玻璃載體芯片、多孔凝膠覆蓋芯片及微孔芯片。此外還可根據(jù)用途不同將其分為蛋白質(zhì)功能芯片與蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片[9]。

蛋白質(zhì)芯片制備與檢測(cè)主要包括載體的選擇及抗體或抗原的固化，抗原或抗體的標(biāo)記，封閉，探針蛋白的制備，抗原抗體的反應(yīng)，蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)等幾個(gè)方面。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：高通量，這一技術(shù)能在一次實(shí)驗(yàn)中提供相當(dāng)大的信息量，使研究者能全面準(zhǔn)確的研究蛋白質(zhì)表達(dá)譜；高靈敏度，它可以檢測(cè)出蛋白樣品中微量蛋白的存在，檢測(cè)水平可達(dá)ng水平；Angelika Lueking等[10]用人類苷油醛-3-磷酸鹽脫氫酶，人類熱休克蛋白片段和鼠免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白抗體制作成抗體陳列，其靈敏度的可檢測(cè)下限為10 fm/mL，而Haab[11]的試驗(yàn)則可將檢測(cè)下限達(dá)到1 ng/mL的水平，并有較高準(zhǔn)確性[12]。

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的起步雖然較晚但其發(fā)展應(yīng)用的領(lǐng)域廣，目前這一技術(shù)主要應(yīng)用于蛋白差異表達(dá)分析、蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-DNA相互作用、小分子-蛋白質(zhì)間相互作用、抗體檢測(cè)、碳水化合物檢測(cè)、疾病診斷等多個(gè)方面。

3 芯片實(shí)驗(yàn)室

芯片實(shí)驗(yàn)室是將樣品制備、生化反應(yīng)及檢測(cè)分析等過(guò)程集約化形成的微型分析系統(tǒng)。現(xiàn)在已有由加熱器、微泵、微閥、微流量控制器、微電極等組成的芯片實(shí)驗(yàn)室問(wèn)世，并出現(xiàn)了將生化反應(yīng)、樣品制備、檢測(cè)和分析等部分集成的生物芯片[13]。雖然由于技術(shù)上的難題，以及應(yīng)用過(guò)程中的復(fù)雜性和市場(chǎng)接受程度的限制，使這一技術(shù)在進(jìn)行應(yīng)用階段還存在相當(dāng)困難，但這可以認(rèn)為是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。

4 組織芯片

組織芯片也稱組織微陣列。這一概念于1998年由Kononen等提出，它可以看成是基因芯片技術(shù)的發(fā)展和延伸，與細(xì)胞芯片、蛋白質(zhì)（抗體）芯片一樣屬于一種特殊形式的生物芯片技術(shù)。這一技術(shù)是將成百上千個(gè)不同個(gè)體的組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)或研究需要排列在一張固相載體（載玻片）上所形成的組織微陣列，是一種高通量、多樣本的分析工具[14]。

5 細(xì)胞芯片

細(xì)胞芯片又稱細(xì)胞微陣列，是2001年由美國(guó)麻省理工學(xué)院的Zlauddin和Sabatinl等人發(fā)明的一種高通量的基因反向轉(zhuǎn)染技術(shù)[15]。其原理是首先將不同的DNA探針點(diǎn)在玻璃片上，做成DNA微陣列芯片，接著用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法處理該DNA微陣列芯片，然后在脂質(zhì)體處理的DNA微陣列上培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，點(diǎn)在芯片上的DNA在轉(zhuǎn)染試劑的作用下原位轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在DNA微陣列的每一個(gè)DNA樣品點(diǎn)的相同位置形成了轉(zhuǎn)染該DNA的細(xì)胞集群，細(xì)胞因獲得了外源DNA 而獲得新的表型[16]。這一技術(shù)可用于藥物的高通量篩選和功能驗(yàn)證，確證藥物作用靶點(diǎn)，尋找能改變細(xì)胞生理狀態(tài)的基因產(chǎn)物等研究領(lǐng)域[17]。

6 糖芯片

糖芯片又稱糖微陣列，是一種用于糖組學(xué)研究的新興工具，根據(jù)芯片上糖的特征可分為單糖芯片、寡糖芯片、多糖芯片和復(fù)合糖芯片；根據(jù)用途可分為功能糖組學(xué)糖芯片和藥物糖芯片。這一芯片技術(shù)可同時(shí)分析空前數(shù)量的多糖—蛋白質(zhì)相互作用，可用于功能糖組學(xué)、藥物篩選、抗體結(jié)合特異性分析、細(xì)胞黏附檢測(cè)和酶測(cè)定及藥物糖組學(xué)等方面的研究[1]。

我國(guó)已有360余項(xiàng)芯片技術(shù)和檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)明專利，其中檢驗(yàn)部分主要為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和診斷。表明我國(guó)在生物芯片的研究和應(yīng)用中已經(jīng)具有初步的技術(shù)基礎(chǔ)。但從技術(shù)基礎(chǔ)和水平上來(lái)看，我國(guó)在生物芯片的技術(shù)研究上水平還較低，生物芯片高通量這一技術(shù)特點(diǎn)尚未從根本上突破，與國(guó)外全基因芯片和極高通量的微珠芯片相比，我國(guó)的芯片同時(shí)檢測(cè)的樣品數(shù)通常低于20個(gè)，而各樣品檢驗(yàn)的指標(biāo)一般不超過(guò)10個(gè)。事實(shí)上芯片技術(shù)迅速發(fā)展，美國(guó)、德國(guó)及瑞典等國(guó)家的高技術(shù)公司在不同種類和不同技術(shù)原理各類芯片上已有了突破性的進(jìn)步，發(fā)展成如微流芯片和微珠芯片等技術(shù)上更為先進(jìn)的芯片技術(shù)，而且已開(kāi)始市場(chǎng)應(yīng)用。這些新技術(shù)的檢驗(yàn)準(zhǔn)確性、通量、感應(yīng)器和指標(biāo)間干擾等均比傳統(tǒng)的微陣列芯片有了飛躍性發(fā)展。因此我國(guó)的研究機(jī)構(gòu)和高技術(shù)醫(yī)學(xué)技術(shù)公司應(yīng)高度重視生物芯片技術(shù)的研究，發(fā)展我國(guó)的準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、低成本和微小生物樣本量的高通量醫(yī)學(xué)診斷和檢驗(yàn)。

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