山東省部分地區(qū)產(chǎn)蛋雞群低致病性禽流感免疫狀況調(diào)查

季大平 李 超 劉立濤

（①山東省沂水縣沙溝鎮(zhèn)獸醫(yī)站 276414 ②山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 泰安 ②山東省夏津縣畜牧獸醫(yī)局）

山東省部分地區(qū)產(chǎn)蛋雞群低致病性禽流感免疫狀況調(diào)查

季大平①李 超②②劉立濤②

（①山東省沂水縣沙溝鎮(zhèn)獸醫(yī)站 276414 ②山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 泰安 ②山東省夏津縣畜牧獸醫(yī)局）

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒引起的一種急性、高度接觸性傳染病。我國(guó)流行的低致病性禽流感為H9N2 亞型禽流感，由于該病毒變異較快，傳播迅速、易感雞病情較重，使世界養(yǎng)禽業(yè)遭受巨大損失。為了解我省產(chǎn)蛋雞群低致病性禽流感的免疫水平、流行情況，自濟(jì)寧、菏澤、青島、泰安、臨沂、聊城、濱州、萊蕪、德州和東營(yíng)10個(gè)地區(qū)商品蛋雞場(chǎng)或種雞場(chǎng)采集雞蛋或血清，進(jìn)行了禽流感H9

亞型HI檢測(cè)，并對(duì)送檢的疑似病例進(jìn)行了綜合診斷。結(jié)果表明，全省各地絕大多數(shù)產(chǎn)蛋雞群尤其是種雞群的低致病性禽流感免疫狀況良好，但也有部分產(chǎn)蛋雞群免疫水平較低，部分雞場(chǎng)已發(fā)生感染。產(chǎn)蛋雞群發(fā)生低致病性禽流感一般為非典型病例，只靠癥狀觀察、剖檢病變不易判定，確診必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 融水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、微量加樣器(Eppendorf公司)、高速臺(tái)式離心機(jī)、Anke.TGL-16G離心機(jī)(上海安亭儀器廠)、96孔V形反應(yīng)板。

1.1.2 主要試劑 （1）PBS溶液的配制：氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸二氫鉀0.24g、十二水磷酸氫二鈉3.63g，溶于1000ml的蒸餾水中，經(jīng)濾器過濾除菌后置4℃保存?zhèn)溆?。?）抗凝劑(3.8%)的配制：枸櫞酸鈉或是檸檬三酸鈉3.8g，溶于100ml的蒸餾水中。

1.1.3 樣品 分別來(lái)自濟(jì)寧、菏澤、青島、泰安、臨沂、聊城、濱州、萊蕪、德州和東營(yíng)10個(gè)地市的開產(chǎn)商品蛋雞場(chǎng)或種雞場(chǎng)送檢的雞蛋或是血清。

1.1.4 1%的紅細(xì)胞懸液的制備 將適量的抗凝劑倒于10ml的離心管中，再抽取健康成年雞的靜脈血放置到離心管中混勻，2000r/min離心10min，棄上清液，再加PBS緩沖液，共重復(fù)離心洗滌3次，其中每一次都將上清液以及紅細(xì)胞表面的白膜吸干凈，3次完成之后，用PBS配成1%的紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 診斷試劑 H9N2標(biāo)準(zhǔn)抗原。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA) （1）取一塊潔凈的96孔V型微量血清反應(yīng)板，用微量吸液器在兩排孔中加入PBS，每孔中加入50ml。（2）取待檢病毒液50ml加入第一列的第1孔中，充分混勻后取50ml加入第2孔中，如此直至第11孔，混合后吸取50ml丟棄，第12孔不加病毒為對(duì)照孔。（3）更換移液器槍頭，每孔中加入50ml的1%的紅細(xì)胞懸液。（4）將反應(yīng)板置于微型混合器上，振動(dòng)混合3min，取下置37℃溫箱中保存15min，混勻，37°C溫箱中放置15～20min，觀察結(jié)果(表1)。

表1 禽流感病毒血凝試驗(yàn) (ml)

紅細(xì)胞全部凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為該病毒的凝集效價(jià)64倍。

1.2.2 血凝抑制試驗(yàn)(HI) （1）取清潔的96孔V型微量血清反應(yīng)板，在每孔中加入PBS50ml。（2）將被檢血清50ml加入第一排的第1孔中，充分混勻，取50ml加入第2孔中，如此稀釋直至第11孔，第12孔不加血清作為對(duì)照。（3）根據(jù)血凝試驗(yàn)測(cè)定的病毒效價(jià)，配制4個(gè)血凝單位的病毒稀釋液。例如，上述血凝價(jià)為64倍時(shí)，將病毒原液稀釋至16倍時(shí)(64/4=16)，即為4單位病毒稀釋液。在每孔中加入4IU病毒稀釋液50ml。（4）將反應(yīng)板置于微型混合器上，振動(dòng)混合3min，取下置37℃溫箱中保存15～20min，觀察結(jié)果。(表2)

表2 禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn) (ml)

使紅細(xì)胞凝集全部被抑制的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的血凝抑制效價(jià)128倍，這里只選取了一個(gè)樣品的結(jié)果。

通過以上方法，對(duì)送檢的雞蛋或是血清做H9的血凝和血凝抑制試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

表3 山東省部分地區(qū)低致病性禽流感HI不同抗體滴度的比例

由上表統(tǒng)計(jì)的結(jié)果可以看出，各地區(qū)免疫雞群H9亞型的HI抗體水平較高的例數(shù)，平均在75.5%，抗體水平較低的例數(shù)11.8%，其中疑似感染的雞群比例在12.7%左右，這說(shuō)明雖然有部分雞群的免疫效果較差并且部分發(fā)生感染，但是送檢地區(qū)的免疫雞群整體免疫效果較好，H9亞型禽流感暫時(shí)不會(huì)造成嚴(yán)重危害。

3 結(jié)論與討論

省內(nèi)各地區(qū)禽流感H9亞型的免疫效果較好，沒有出現(xiàn)較大范圍的疫情爆發(fā)。低致病性禽流感(LPAI)是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要疾病。近年來(lái)，在世界各地均有流行報(bào)道，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大。其中，H9亞型禽流感呈地方流行、持續(xù)存在，仍然是我國(guó)目前禽流感流行的主要亞型。LPAIV導(dǎo)致的禽流感常以呼吸道癥狀、氣管腫脹出血、干酪樣滲出物、產(chǎn)蛋率下降為主要特征。本病的病程較長(zhǎng)，發(fā)病率高，但是死亡率低。血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HI抗體的常用方法，該方法簡(jiǎn)單、迅速，能夠較為準(zhǔn)確的反映雞場(chǎng)的流感疫苗免疫水平，監(jiān)測(cè)疫情狀況。雖然此次的抗體檢測(cè)結(jié)果表明各地區(qū)的H9亞型禽流感防疫效果較好，但是鑒于禽流感有著重大威脅，所以還是要定期的免疫、檢測(cè)，以有效地防止流感的發(fā)生。

S858.31

A

1007-1733(2013)03-0048-02

2012–12–28）