果酒酵母選育及酵母對(duì)香氣成分影響的研究進(jìn)展

劉永衡，華惠敏，吳桂君，張 琪

（銀川能源學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程系，寧夏 永寧 750105）

果酒是以新鮮水果為原料，利用自然發(fā)酵或人工添加酵母菌來分解糖分而制造出的具有保健、營養(yǎng)作用的低度飲料酒如葡萄酒、蘋果酒、李子酒等。果酒不僅具有水果的天然香味而且富含多種維生素和氨基酸，在提倡健康生活的現(xiàn)代社會(huì)深受青睞。新鮮水果由于含水量高、產(chǎn)后呼吸代謝旺盛、極易腐爛，不耐貯存，果實(shí)成熟采摘后若不及時(shí)處理將造成腐爛，這對(duì)果農(nóng)種植的積極性有不可忽視的負(fù)面影響。果酒生產(chǎn)不僅解決了水果不耐貯存的問題，而且提高了產(chǎn)品的附加值。在釀造過程中，不同的果酒酵母以及發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質(zhì)對(duì)于果酒的風(fēng)格有著重要的影響。隨著果酒釀造業(yè)的迅速發(fā)展，為了更系統(tǒng)深入的研究果酒的品質(zhì)，人們對(duì)于果酒的研發(fā)除了傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝以及感官品質(zhì)外，對(duì)于果酒酵母的選育和香氣成分的分析等更深層次的探索研究也越來越受到關(guān)注。

1 果酒酵母的選育

菌種的篩選來源主要有2個(gè)途徑：選種和育種。前者是指從自然樣本中通過篩選與分離獲得菌株；后者是指在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)已有、保藏的微生物菌株進(jìn)行遺傳改良[1]。近年來，隨著果酒市場以及人們消費(fèi)水平的發(fā)展趨勢逐年增高，原有的傳統(tǒng)自然發(fā)酵已經(jīng)不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為提高生產(chǎn)效率，篩選添加酵母發(fā)酵的研究應(yīng)用開始逐漸增多。果酒釀造中使用的酵母包括釀酒酵母和非釀酒酵母，釀酒酵母主要是一些葡萄酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），而非釀酒酵母屬的酵母或稱為產(chǎn)香酵母，主要有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、克勒克酵母屬（Kloeckera）、假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）等酵母。由于傳統(tǒng)釀酒酵母釀造的果酒風(fēng)味較為平淡，為改善風(fēng)味，非釀酒酵母的選育逐漸成為近年來新的果酒研究方向。有研究表明，非釀酒酵母會(huì)對(duì)果酒的總體風(fēng)味產(chǎn)生積極的影響，能生成更多的芳香物質(zhì)和特別的風(fēng)味成分，使果酒的風(fēng)味特征明顯改善[2]。

1.1 果酒酵母的選種技術(shù)

果酒酵母的篩選多來自于成熟果實(shí)的表皮、自然腐爛發(fā)酵的果肉、果汁以及果園的土壤等。目前大多數(shù)選種研究集中在優(yōu)良傳統(tǒng)釀酒酵母的自然篩選以及馴化方面，尤其是在歐美一些注重果酒傳統(tǒng)品質(zhì)的國家。如BELL PJL等[3]以野生釀酒菌株（S cerevisiae）為研究對(duì)象，在高滲透壓下的條件下經(jīng)過馴化后得到了具有更高的麥芽轉(zhuǎn)化率的菌株。EZERONYE OU[4]以4種熱帶水果果汁為發(fā)酵底物，比較篩選了棕櫚酒酵母OW-11以及釀酒酵母CBS 8066和ATCC 4126的培養(yǎng)基利用效率以及生長速率，通過測定酵母生長OD值以及殘?zhí)堑壤砘笜?biāo)，證明棕櫚酒酵母OW-11的各方面發(fā)酵性能都優(yōu)于其他兩種菌株，有望用于葡萄酒的工業(yè)生產(chǎn)。近年來國內(nèi)在果酒酵母的選種鑒定研究也取得了一定的成績，果酒研發(fā)不再局限于使用傳統(tǒng)的葡萄酒酵母，而是篩選新的專用果酒酵母。周幗萍等[5]以木瓜和市售各種帶酒味的腐爛水果表面為分離源，分離得到68株酵母菌，經(jīng)過三級(jí)篩選獲得3株適合釀造木瓜果酒的酵母菌，編號(hào)分別為Y-3-1、Y-4-1和Y-9-1。經(jīng)感官評(píng)定，采用這3株菌所釀制的木瓜果酒明顯優(yōu)于常用的釀酒用耐高溫活性安琪酵母。方亮等[6]從黑莓自然發(fā)酵物中經(jīng)過三級(jí)分離篩選得到1株適宜黑莓果酒發(fā)酵的酵母菌，命名為CNBG001。該菌株酒精耐受能力可達(dá)16%vol，耐SO2能力可達(dá)200mg/L，是1株優(yōu)良的黑莓果酒釀造酵母。謝建華等[7]為篩選得到適合發(fā)酵楊梅果酒的酵母菌株，從優(yōu)質(zhì)自然發(fā)酵楊梅汁中分離篩選到一株酵母Y-9，對(duì)該酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化等試驗(yàn)，結(jié)果顯示，楊梅酒中的酵母菌為郎比可酒香酵母（Brettanomyces lambicus）。目前，果酒酵母菌種的選種技術(shù)還存在著一定的局限性，如分離篩選得到的菌種鑒定不夠成熟、系統(tǒng)，大部分研究僅僅局限于形態(tài)、生理學(xué)以及發(fā)酵性能的比較鑒定，而對(duì)于其生物分類、分子生物學(xué)層次的鑒定研究鮮有報(bào)道。建議從分子角度更深層次的研究酵母選種，以便于為轉(zhuǎn)基因高性能菌種的研究提供基礎(chǔ)。此外，從自然界篩選的野生酵母很難具有理想的特性直接用于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)，需要進(jìn)一步的馴化培養(yǎng)和利用現(xiàn)代的育種技術(shù)進(jìn)行遺傳性狀改良，使其能達(dá)到工業(yè)大生產(chǎn)的要求。

1.2 果酒酵母的育種技術(shù)

微生物菌種育種技術(shù)可分為誘變育種技術(shù)、基因重組育種技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，一株經(jīng)過遺傳改良的菌株可以使其原有生產(chǎn)性狀有明顯的改善和較大幅度的提高，有利于現(xiàn)代工業(yè)化大規(guī)模釀酒的高效生產(chǎn)及控制。

1.2.1 誘變育種技術(shù)

誘變育種是利用自發(fā)突變?cè)?，讓微生物接觸到諸如紫外線輻射、電離輻射（X射線、γ射線或中子等）和許多能與DNA堿基反應(yīng)或干擾DNA復(fù)制的各類誘變劑（如硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、5-溴尿嘧啶（5-bromine uracil，5-BU）、氮芥（nitrogen mustard，NM）、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）等），將突變頻率增加數(shù)倍以上，再配以有效的培養(yǎng)選擇，以期獲得性狀和生產(chǎn)特性顯著提高或改善的新菌株。由于這種技術(shù)操作比較簡單，條件和設(shè)備要求都較低，因此得到了廣泛的應(yīng)用。為提高誘變效果，目前誘變育種多采用復(fù)合誘變，即用兩種以上的誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理。如趙祥杰等[8]將篩選到的一株桑椹果酒酵母經(jīng)紫外輻照和微波處理，最終篩選到的ME44菌株在兩周發(fā)酵周期內(nèi)酒精體積分?jǐn)?shù)為11.7%，比出發(fā)菌株提高7%以上，而且菌株在起酵時(shí)間及果酒品質(zhì)方面都有提高。此外，將酵母出發(fā)菌株進(jìn)行原生質(zhì)體制備處理也可以極大地提高突變頻率，是目前較普遍的酵母誘變育種方法，如王玲等[9]以1株自行分離的菠蘿果酒酵母菌H10為出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體后進(jìn)行紫外誘變選育優(yōu)良突變菌株，經(jīng)篩選后得到1株對(duì)菠蘿汁發(fā)酵能力強(qiáng)、產(chǎn)香能力好、耐乙醇和SO2、遺傳穩(wěn)定性好、適合熱帶地區(qū)菠蘿果酒生產(chǎn)的優(yōu)良酵母菌株H10-15。近年來，隨著科技的不斷進(jìn)步，太空育種成為了新的研究焦點(diǎn)，太空育種主要是通過強(qiáng)輻射，微重力和高真空等太空綜合環(huán)境因素誘發(fā)植物種子的基因變異。作為現(xiàn)代微生物育種的技術(shù)之一，其具有變化率高、變化幅度大、有益變化多、變化穩(wěn)定快、變化后遺傳性好等優(yōu)點(diǎn)。近期有新聞報(bào)道稱燕京酵母菌種搭載“神舟十號(hào)”遨游太空，在不久的將來，相信會(huì)有更多的酵母菌種包括果酒酵母進(jìn)行太空育種研究。雖然誘變育種技術(shù)有其操作簡單、技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，但是其步驟繁瑣，從誘變處理到菌種篩選、發(fā)酵性能測試都需要大量的工作，整個(gè)研究周期長，而且該技術(shù)存在著一定的盲目性、工作效率低等缺點(diǎn)，如誘變得到的上百株菌株很有可能都是原有優(yōu)良性狀退化的負(fù)突變菌株，對(duì)于優(yōu)良突變菌株的突變性狀也存在著未知性。

1.2.2 基因重組育種技術(shù)

基因重組育種是基因型不同的個(gè)體交配產(chǎn)生不同于親本基因型的個(gè)體，其本質(zhì)是個(gè)體之間遺傳信息的重組。酵母菌的基因重組育種主要包括雜交育種和原生質(zhì)體重組育種，雜交育種是指利用不同接合型的單倍體酵母菌株或子囊孢子進(jìn)行的重組育種，此技術(shù)可以消除菌株在經(jīng)歷長期誘變后所出現(xiàn)的產(chǎn)量性狀難以繼續(xù)提高的障礙，因此是一種重要的育種手段。BELLON JR等[10]利用雜交育種技術(shù)將非釀酒酵母（S.kudriavzevii）和釀酒酵母（S.cerevisiae）進(jìn)行了雜交，結(jié)果表明以雜交后的新菌株（AWRI 1503）釀造的酒比以親本釀造的酒在香氣及風(fēng)味口感上的表現(xiàn)均較好，目前已應(yīng)用于商業(yè)化的葡萄酒生產(chǎn)。原生質(zhì)體融合技術(shù)是將兩親株先經(jīng)酶法破壁制備原生質(zhì)體，然后用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，促進(jìn)兩親株原生質(zhì)體融合，經(jīng)染色體交換、重組而達(dá)到雜交目的，通過篩選獲得集兩親株優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子。與傳統(tǒng)雜交育種相比，該技術(shù)大大縮短了育種的時(shí)間，并且重組后的菌株更加穩(wěn)定。如張琇等[11]從靈武長棗果皮上篩選分離出一株性能優(yōu)良的釀酒酵母（YLLJ），將其制備成原生質(zhì)體與紅酵母原生質(zhì)體在促融合劑聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作用下進(jìn)行融合，最終得到的融合子既有釀酒能力又能產(chǎn)類胡蘿卜素。INFANTE MAJOLLI MV等[12]以釀酒酵母和文氏曲霉（Aspergillus wentii）為親本株進(jìn)行原生質(zhì)體融合研究，通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選出了3株能夠產(chǎn)生優(yōu)雅果香的融合子。基因重組技術(shù)在果酒酵母的選育方面研究仍然較少，這也許跟該技術(shù)難以消除種屬間的遺傳隔閡有關(guān)，即遠(yuǎn)緣雜交不親和，比如不同種屬間微生物的優(yōu)良性狀很難通過重組而獲得新遺傳型的菌株。國內(nèi)尚未見到酵母菌株與其他屬菌株的重組育種研究（如酵母和霉菌），有關(guān)此方面的研究技術(shù)空白希望能夠得到填補(bǔ)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，經(jīng)過導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，又稱基因工程，其與基因重組育種技術(shù)最大的區(qū)別在于基因重組育種的重組方式是體內(nèi)重組，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是體外重組，可以定向的對(duì)生物體進(jìn)行遺傳改良。目前國內(nèi)對(duì)于果酒酵母轉(zhuǎn)基因育種的研究鮮有報(bào)道，大部分研究工作來源于國外，這可能也是因?yàn)閲鴥?nèi)技術(shù)條件以及果酒酵母轉(zhuǎn)基因研發(fā)支持力度的限制。BORNEMAN AR等[13]在酵母菌株AWRI796發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的編碼合成芳基醇脫氫酶（aryl-alcohol dehydrogenase，AAD）的基因，將此基因?qū)氲狡渌湍赴l(fā)現(xiàn)在發(fā)酵期間乙醇產(chǎn)率以及香氣成分都有所提高。DUFOUR M等[14]對(duì)多株釀酒酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)基因遺傳修飾改良，將β-lyaseIrc7p基因轉(zhuǎn)移到了這些酵母菌株后，發(fā)現(xiàn)新的菌株可以產(chǎn)生更多的半胱氨酸共軛型揮發(fā)性硫醇，可以改善酒的香氣風(fēng)味。葛向陽等[15]將編碼海藻糖合酶復(fù)雜的調(diào)節(jié)亞基基因TSL1在釀酒酵母Z-06中過度表達(dá)，最終發(fā)現(xiàn)酵母菌對(duì)高溫的抗逆性以及葡萄糖消耗率都有所提高。相比于以上幾種育種技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)除過研究成本較高外，其目標(biāo)性強(qiáng)、消除了遺傳隔閡等優(yōu)點(diǎn)都是其他幾種技術(shù)無法比擬的。目前國內(nèi)外對(duì)于優(yōu)良果酒酵母菌株基因組的分析與應(yīng)用研究依然很少，對(duì)于能夠提升果酒品質(zhì)的菌株基因分析及轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用有待于進(jìn)一步加強(qiáng)。近年來，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，酵母菌的基因組結(jié)構(gòu)及功能也在逐步揭示，該技術(shù)有望大規(guī)模應(yīng)用于果酒釀造工業(yè)。

2 酵母對(duì)果酒香氣成分的影響

香氣成分是影響果酒風(fēng)味質(zhì)量的重要因素，果酒香氣主要有2部分組成：果實(shí)的原生香以及釀造后產(chǎn)生的發(fā)酵香。原生香是果實(shí)在生長成熟的過程中自身產(chǎn)生的一些揮發(fā)性物質(zhì)；發(fā)酵香是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣成分，發(fā)酵時(shí)，酵母將糖轉(zhuǎn)化為酒精，同時(shí)產(chǎn)生出多種原生香中不存在的香味物質(zhì)，主要包括酯類、高級(jí)醇類、有機(jī)酸、酮類等，少數(shù)酵母通過代謝能夠產(chǎn)生一些在植物花朵含量較高的香氣成分，如單萜[16]。但大量研究表明，酯類和高級(jí)醇類是果酒香氣中含量最多的成分，如3-甲基丁醇、正戊醇、苯乙醇、丁二酸乙酯等[17-21]。果酒香氣成分的研究方法主要是一些提取分離手段結(jié)合氣質(zhì)（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，國內(nèi)外學(xué)者在此方面的研究較多，BUTKHUP L等[22]利用固相微萃取聯(lián)合GC-MS技術(shù)分析了桑葚酒的香氣成分，共發(fā)現(xiàn)80種揮發(fā)性成分，主要包括高級(jí)醇類、脂肪酸、醚類、揮發(fā)性酚類物質(zhì)。REDDY LVA等[23]以芒果為原料發(fā)酵釀酒，通過GC-MS跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)了32種揮發(fā)性成分，其中部分成分在新鮮芒果中不存在，除過乙醇、正丙醇、異丁醇、乙酸乙酯等主要醇類、酯類成分，還生成了少量的丁酸苯乙酯、環(huán)己烷類的成分。此外，分析方法越先進(jìn)，儀器越精密，同樣的果酒發(fā)現(xiàn)的香氣成分越多，如JANACOVA A等[24]利用氣相色譜-嗅覺測量法（gas chromatography-olfactomety，GCO）聯(lián)合GC-MS技術(shù)從一種酒中發(fā)現(xiàn)了227種化合物。

2.1 酵母發(fā)酵過程對(duì)香氣成分的影響

酵母發(fā)酵過程對(duì)果酒香氣成分有著重要的影響，尤其表現(xiàn)在釀造前后以及時(shí)間長短方面。DUNLEVY JD等[25]研究發(fā)現(xiàn)葡萄漿果與發(fā)酵后葡萄酒的香氣成分差異很大，尤其表現(xiàn)在單萜類成分和2-甲氧基吡嗪類成分的變化，此外研究表明葡萄漿果的原生香氣成分對(duì)葡萄酒品質(zhì)影響并無直接關(guān)系。這說明隨著發(fā)酵的時(shí)間變化，酵母菌在果酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也在發(fā)生著不斷的變化。而且果酒的香氣主要是在酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生，與原料本身的揮發(fā)性香氣成分聯(lián)系較小。如陳娟等[26]從大十桑椹汁、蜂蜜桑椹發(fā)酵原酒和陳釀酒中分別檢測出揮發(fā)性成分51種、64種和68種。通過成分對(duì)比發(fā)現(xiàn)桑椹汁香氣成分主要以棕櫚酸和亞油酸2種高級(jí)脂肪酸為主，發(fā)酵原酒和陳釀酒則以低級(jí)脂肪醇、酯、酸和酮以及芳香醇等為主要香氣成分，而且通過比較發(fā)現(xiàn)大十桑椹果汁經(jīng)發(fā)酵和陳釀過程后，香氣成分的數(shù)量和相對(duì)含量變化很大。從這些研究可以看出酵母對(duì)于香氣成分的影響較大，對(duì)果酒品質(zhì)有重要的作用。

2.2 不同酵母菌對(duì)果酒香氣成分的影響

同一酵母屬的各種釀酒酵母所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)有較大的差別，不同屬間酵母所產(chǎn)的揮發(fā)性物質(zhì)有更大的差異，比如有的酵母酒精產(chǎn)率高，而有的酵母其發(fā)酵產(chǎn)品的殘?zhí)呛鸵宜嵋阴サ暮枯^高。在果酒的發(fā)酵過程中，酵母種類對(duì)高級(jí)醇的形成影響較大，一些研究證明非釀酒酵母比釀酒酵母能產(chǎn)更多的高級(jí)醇，國外學(xué)者在這方面的研究起步很早，如POLLARD A等[27]比較了從蘋果汁中分離的各種酵母和人工酵母所產(chǎn)高級(jí)醇、苯乙醇濃度，并與自然發(fā)酵的天然酵母進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母屬酵母產(chǎn)高級(jí)醇能力差別很大，球擬酵母（Torulopsis datilla）所產(chǎn)高級(jí)醇濃度最低，檸檬形克勒克酵母（Klorekera apiculata）所產(chǎn)高級(jí)醇濃度最高。此外，天然酵母產(chǎn)香豐富，人工釀酒酵母產(chǎn)香較淡且純凈。WUCHERPEFENNIG K等[28]分別研究了野生酵母（Apiculauts yeast）和人工培養(yǎng)的酵母（Geisenheim Nr.49）生產(chǎn)的蘋果灑的風(fēng)味，發(fā)現(xiàn)野生酵母能產(chǎn)生更多的揮發(fā)物質(zhì)，形成風(fēng)格典型的蘋果酒，人工培養(yǎng)的酵母產(chǎn)香弱，能生產(chǎn)香氣淡雅的蘋果酒。能產(chǎn)更多醇類的酵母也能產(chǎn)更多的酯類成分，這種情況在厭氣條件下更為明顯。國內(nèi)此方面的研究起步較晚且鮮有報(bào)道，李銳等[29]研究不同來源釀酒酵母對(duì)柑橘果酒香氣成分的影響，以錦橙表皮和柑橘園土壤為酵母的來源，篩選得到3株酵母菌L3、L5、L9，通過測定多項(xiàng)理化指標(biāo)結(jié)果顯示3株酵母所釀柑橘果酒的香氣成分有特異性差異，庚酸乙酯、萜品油烯等13種物質(zhì)為L3酵母菌所釀柑橘果酒獨(dú)有；月桂醇、乙酸異丁酯等8種物質(zhì)僅見于L5酵母菌所釀柑橘果酒中；正辛醇、5-甲基呋喃醛等4種物質(zhì)只在L9酵母菌所釀柑橘果酒中存在。柳素潔等[30]采用5種釀酒酵母：W15、EC1118、S7、L45、71B進(jìn)行香蕉漿發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)不同酵母釀造的香蕉果酒在總酸、總酯、香氣成分等方面都有所差異，也因此篩選出了最佳的香蕉蒸餾酒生產(chǎn)用酵母為EC1118，其釀造的果酒具有乙酸乙酯為主體的清雅、諧調(diào)的香氣和辛酸乙酯的典型香蕉味。研究酵母菌和果酒香氣之間的聯(lián)系對(duì)于果酒酵母的篩選和提高果酒的品質(zhì)都有重要的參考意義，目前國內(nèi)外在酵母菌與香氣成分聯(lián)系方面的研究存在缺乏系統(tǒng)性以及研究深度不夠等問題，例如在酵母產(chǎn)香氣成分的代謝途徑機(jī)制闡明方面的研究仍然處于空白地位，這些問題都有待于進(jìn)一步解決。

3 展望

我國水果年產(chǎn)量約8000多萬t，位居世界首位，但我國水果深加工能力較國外依然很落后。隨著人民生活水平的提高以及果酒生產(chǎn)者加工技術(shù)不斷發(fā)展，近年來我國果酒業(yè)結(jié)束了長期徘徊不前的局面，發(fā)展呈現(xiàn)出良好的態(tài)勢，市面上果酒的品種也越來越多。在果酒的生產(chǎn)工藝以及設(shè)備研究日趨成熟的同時(shí)，對(duì)于果酒的品質(zhì)研究也應(yīng)該重視，因此選育優(yōu)良專用的果酒酵母代替葡萄酒用酵母，加深對(duì)果酒的主要香氣成分及其形成機(jī)理進(jìn)行研究以便于控制好影響果酒香氣形成的因素，這些研究都可以使果酒特征更加突出，品質(zhì)更加優(yōu)良，對(duì)于促進(jìn)果酒釀造工業(yè)的發(fā)展很有必要。

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