不容忽視的潛在的人畜共患?。i戊型肝炎

王 衡，寧章勇，梁煥斌，古洪浪，張桂紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642）

2003年，有報(bào)道稱(chēng)日本發(fā)現(xiàn)兩例戊型肝炎（Hepatitis E，HE）感染病例，1例53歲患者盡管早期出現(xiàn)嚴(yán)重的肝炎癥狀，但很快恢復(fù)健康；另1例70歲患者出現(xiàn)同樣的初期肝炎癥狀，但隨后出現(xiàn)肝昏迷并死亡于突發(fā)性肝衰竭。病原分離得知兩例患者感染的為Ⅳ型肝炎病毒；流行病學(xué)調(diào)查表明，在3個(gè)月內(nèi)2人共同食用5次未熟的野豬肝［1］。另外，香港明報(bào)新聞網(wǎng) （http：／／www．chinanews．com／ga／2010／12－30／2758109．shtml）在2010 年年末報(bào)道了這樣一則新聞，稱(chēng)香港食物安全中心表示，香港的戊型肝炎由1998年起逐漸上升，至2010年已達(dá)100宗，數(shù)字為歷來(lái)的新高?；颊咄ǔＳ邪l(fā)燒、嘔吐、眼黃及尿液呈茶色等病征，報(bào)道同時(shí)指出，戊型肝炎患者多曾去過(guò)高危地方，或曾食用貝或豬肝等食物，以致染病。雖然兩則報(bào)道相距7年，但在這7年里，世界各地尤其是發(fā)展中國(guó)家類(lèi)似的報(bào)道數(shù)不勝數(shù)。這提示我們戊型肝炎病毒正隱蔽在家畜、家禽及野生動(dòng)物體內(nèi)，并悄悄地“潛伏”在我們周?chē)?/p>

戊型肝炎是引起暴發(fā)性及散發(fā)性肝炎的主要原因，血清學(xué)調(diào)查表明［2］，世界1／3人口曾經(jīng)感染過(guò)戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）。無(wú)論是在發(fā)展中國(guó)家還是在發(fā)達(dá)國(guó)家，戊型肝炎都不再是一種罕見(jiàn)的疾病，在發(fā)達(dá)國(guó)家每年約有1．3萬(wàn)～2．6萬(wàn)人慢性肝炎患者因合并HE死亡［3］。戊型肝炎具有比較明顯的年齡特異性，對(duì)于老年人、慢性肝炎患者及孕婦危害性尤高，孕婦感染HEV的死亡率可達(dá)20%［4］。眾多研究表明，豬HEV可能是人感染HEV的主要來(lái)源之一，因此，積極開(kāi)展動(dòng)物源性HEV的研究將會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生及動(dòng)物源性食品安全的實(shí)施具有巨大的幫助。

1 豬戊型肝炎病原學(xué)與流行病學(xué)

HEV屬于單股正鏈RNA病毒，是戊肝病毒屬的惟一成員。目前已經(jīng)鑒定出兩種截然不同的HEV，一種是感染哺乳動(dòng)物的HEV，包括4個(gè)基因型，可以引起人類(lèi)的急性肝炎，目前認(rèn)為豬及其他多種動(dòng)物可能作為其重要的儲(chǔ)存器；一種是感染禽類(lèi)的HEV，只含有1個(gè)基因型，可引起雞出現(xiàn)肝脾腫大癥狀。其中前者，被認(rèn)為可能是一種豬源的人獸共患病，也是目前動(dòng)物源性人獸共患病的研究熱點(diǎn)之一，該病毒具有一個(gè)7．2kb的基因組，含有3個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），分別為編碼具有復(fù)制功能的多聚蛋白的ORF1、編碼病毒衣殼蛋白的ORF2以及編碼具有調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白激酶活性的ORF3。

根據(jù)病毒基因的變異性，我們將感染哺乳動(dòng)物的HEV分為4個(gè)基因型［5］：分別是以亞洲和非洲分離株為主的Ⅰ型；以墨西哥株及少量非洲散發(fā)疫區(qū)分離株為主的Ⅱ型；以分離自發(fā)達(dá)國(guó)家并可以是人源或豬源分離株為主的Ⅲ型；以亞洲分離株為主，尤其是主要發(fā)現(xiàn)于中國(guó)及日本的基因型Ⅳ型。

目前在我國(guó)大部分地區(qū)［6－8］，不但在人群中可以檢測(cè)到高比例HEV陽(yáng)性血清的存在，同時(shí)在家畜（豬、馬、牛、羊）及寵物（犬）體內(nèi)同樣可以發(fā)現(xiàn)高比例的HEV陽(yáng)性血清，特別是在豬群中感染率尤為明顯，但HEV RNA陽(yáng)性率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其血清陽(yáng)性率。通過(guò)對(duì)我國(guó)分離到的病毒測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是人源還是動(dòng)物源的HEV大多數(shù)屬于Ⅳ型。而且對(duì)我國(guó)東部及南部的分離株分析發(fā)現(xiàn)，豬HEV與人HEV具有較高的相似性。因此有學(xué)者推測(cè)，豬可能是HEV重要的儲(chǔ)存器［9］，并通過(guò)污染水源［10］和食品［11］，作為一種人獸共患病病原在豬群及人群中自由傳播。通過(guò)對(duì)我國(guó)部分地區(qū)，如我國(guó)上海、北京、湖南、廣西及內(nèi)蒙古等西部省份不同豬群調(diào)查表明，不同日齡、不同養(yǎng)殖方式的豬群中HEV陽(yáng)性血清均維持在一個(gè)較高水平，3月齡以上豬群感染率高于三月齡以下豬群［4］，散養(yǎng)豬群血清陽(yáng)性率尤高，在北京部分散養(yǎng)豬群中陽(yáng)性率可達(dá)90%以上［12］。因此可以推斷，我國(guó)大多數(shù)地區(qū)的大多數(shù)豬群均有過(guò)HEV的感染經(jīng)歷，而且部分豬群正處于隱性感染階段。

盡管自然感染HEV豬群很少出現(xiàn)典型的臨床癥狀或發(fā)病，但我國(guó)不同豬群HEV高感染水平的現(xiàn)狀我們不能夠忽視，因?yàn)樨i群具有潛在的作為HEV儲(chǔ)存器的能力。同時(shí)有研究表明，豬HEV可能跨種間傳播給人類(lèi)，因此針對(duì)豬HEV的展開(kāi)深入的研究，對(duì)于公共衛(wèi)生、器官移植及動(dòng)物源性食品安全有著重要的意義。

2 豬戊型肝炎診斷方法

豬HEV具有跨宿主傳播給人類(lèi)的可能，對(duì)該病毒進(jìn)行及時(shí)有效的診斷十分重要。目前實(shí)驗(yàn)室常用的豬HEV診斷方法有PCR、ELISA、免疫組化、原位雜交及其他分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。

2．1 用于豬HEV檢測(cè)的PCR方法 由于豬HEV屬于單股正鏈RNA病毒，因此實(shí)驗(yàn)室最早采用RT－PCR方法進(jìn)行該病原的檢測(cè)，Huang等［13］針對(duì)病毒ORF2段基因設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出大小為392 bp的產(chǎn)物，用于RT－PCR的檢測(cè)，該方法不但可以進(jìn)行的病原的檢測(cè)，而且序列分析表明，美國(guó)豬HEV流行株與美國(guó)人HEV流行株具有高于79%的相似性。另外一種PCR方法為巢式RT－PCR（nRT－PCR），Choi等［14］最早設(shè)計(jì)兩對(duì)引物對(duì)福爾馬林固定的肝臟進(jìn)行了豬HEV的檢測(cè)，試驗(yàn)方法具有很好的特異性，目前該方法在很多實(shí)驗(yàn)室中被廣泛應(yīng)用。隨著實(shí)時(shí)定量PCR方法（Real－Time PCR）的不斷改進(jìn)和完善，在豬HEV檢測(cè)技術(shù)中又相繼出現(xiàn)了 SYBR GreenⅠReal－Time PCR［15］和TaqMan Real－Time PCR［16］方法，這些方法不但有高于nRT－PCR的靈敏性，而且可以用于多重檢測(cè)方法的建立。為建立一種靈敏可視化PCR檢測(cè)方法，本人所在研究團(tuán)隊(duì)建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop－Mediated Isothemal PCR，LAMP）用于該病毒的檢測(cè)，試驗(yàn)方法具有與nRT－PCR相同的靈敏性，可有效的用于臨床樣品的檢測(cè)（研究結(jié)果未發(fā)表）。

2．2 用于豬HEV檢測(cè)的ELISA方法 由于HEV病毒血癥持續(xù)的時(shí)間較短，在流行學(xué)病調(diào)查中單獨(dú)使用PCR檢測(cè)結(jié)果，會(huì)造成結(jié)果的片面性，因此常常采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用于HEV抗體的檢測(cè)，以對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充。Engle等［17］將豬HEV和人HEV重組ORF2蛋白用于ELISA方法的建立，盡管二者在氨基酸序列上存在5%的差異性，但試驗(yàn)結(jié)果表明，二者可同時(shí)用于豬和人HEV抗體的檢測(cè)，這表明兩種HEV在OFR2段可能存在相同的抗原決定簇。Hu等［18］通過(guò)對(duì)豬HEV ORF2基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在其394～660bp之間集中存在病毒的構(gòu)象表位，因此將其表達(dá)后包被于固相載體上，并結(jié)合應(yīng)用該蛋白過(guò)氧化物酶標(biāo)記產(chǎn)物，建立了雙抗原夾心ELISA檢測(cè)方法用于HEV抗體的檢測(cè)，該方法不但具有較強(qiáng)的靈敏性和特異性，而且可以用于HEV感染后14d血清的檢測(cè)。另有研究表明，應(yīng)用Ⅲ型HEV桿狀病毒重組衣殼蛋白也可以有效地用于其血清的檢測(cè)［19］。

目前，國(guó)內(nèi)有使用國(guó)外進(jìn)口豬HEV ELISA試劑盒用于國(guó)內(nèi)豬血清檢測(cè)的報(bào)道，國(guó)外ELISA試劑盒中包被抗原多為Ⅱ型或Ⅲ型HEV，與目前國(guó)內(nèi)主要流行Ⅳ型HEV在基因型存在較明顯的差別。雖然國(guó)外進(jìn)口豬HEV ELISA試劑盒用于國(guó)內(nèi)豬血清檢測(cè)時(shí)可以檢測(cè)到陽(yáng)性血清的存在，但其結(jié)果是否能夠客觀反映流行水平，還有待進(jìn)一步討論。

2．3 用于豬HEV檢測(cè)的免疫組織化學(xué)和原位雜交方法 免疫組織化學(xué)法和原位雜交檢測(cè)方法可以用于檢測(cè)病原的組織分布，甚至檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的定位。Chio［20］等人首先應(yīng)用一段長(zhǎng)度為289bp的地高辛標(biāo)記的cDNA探針對(duì)自然感染HEV病豬的肝臟及其他組織進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝臟及膽管內(nèi)可以見(jiàn)到陽(yáng)性信號(hào)的分布，同時(shí)在小腸、大腸、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體及腎臟中也發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性信號(hào)的分布。Ha等［21］最早應(yīng)用免疫組化方法對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，且為福爾馬林固定的自然感染病例樣品進(jìn)行了HEV的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與Chio得到結(jié)果一致。二人的研究結(jié)果表明，豬HEV主要分布于肝臟的肝細(xì)胞，同時(shí)在肝外組織也可以見(jiàn)到少量的分布。另有研究應(yīng)用原位雜交技術(shù)表明，在變性及空泡化的肝細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)現(xiàn)雜交信號(hào)的存在［22］，這提示我們HEV感染豬后僅能引起肝細(xì)胞發(fā)生輕微的病理變化，并使其處于亞臨床癥狀階段。

2．4 其他方法 HEV是一種基因型比較復(fù)雜的病毒，不同國(guó)家和地區(qū)的不同毒株都可能存在一定差異。對(duì)湖南豬HEV流行毒株進(jìn)行序列分析結(jié)果表明，多數(shù)屬于Ⅳ型，但也存在其他基因型的可能［7］。一直以來(lái)多應(yīng)用序列分析的方法進(jìn)行分子流行病學(xué)分析，這種方法稍顯費(fèi)時(shí)費(fèi)力。針對(duì)這種情況，并結(jié)合HEV基因特點(diǎn)，Sun等［10］采用異源雙鏈遷移分析方法（heteroduplex mobility assays，HMA）用于區(qū)分豬HEV野毒株和參考毒株，這種方法不但適用于HEV分子流行病學(xué)的測(cè)序前調(diào)查，對(duì)于其他基因型復(fù)雜的病毒應(yīng)該同樣有效。另外，在檢測(cè)方法方面，本研究團(tuán)隊(duì)最近建立了免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)方法（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA），將穩(wěn)定表達(dá) HEV ORF2蛋白的細(xì)胞系包被于固相載體上，用于其抗體的檢測(cè)，該方法在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用取得了較好的效果（研究結(jié)果未發(fā)表）。

3 豬戊型肝炎病毒感染模型及感染途徑

目前無(wú)論是人HEV還是豬HEV研究面臨的最大問(wèn)題是，還沒(méi)很好細(xì)胞系能夠?qū)ζ溥M(jìn)行穩(wěn)定的傳代培養(yǎng)。但最近有研究顯示［23］，豬和人的某些細(xì)胞系能夠用于豬Ⅳ型HEV的傳代，研究結(jié)果表明，用豬肛門(mén)拭子和肝臟接種豬腎細(xì)胞系（IBRS－2）和人肺癌細(xì)胞（A549），當(dāng)IBRS－2傳代至第8代、A549傳代至22代時(shí)，可以見(jiàn)到細(xì)胞病變的出現(xiàn)，該研究結(jié)果為今后HEV體外試驗(yàn)的開(kāi)展提供了重要信息。

體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)于HEV的研究同樣重要，盡管目前獼猴可以用于HEV的研究［24］，但由于猴子飼養(yǎng)難度較大，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室還無(wú)法正常采用。為尋找獼猴的替代動(dòng)物，有人使用蒙古沙鼠（Mongolian gerbils）作為動(dòng)物模型開(kāi)展的Ⅳ型HEV的研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過(guò)腹膜內(nèi)感染病毒后，病毒血癥和糞便排毒可以持續(xù)接近4周，同時(shí)在腸道和肝臟內(nèi)檢測(cè)到病原的存在［25］。

深入了解HEV的傳播途徑對(duì)預(yù)防、控制病毒的傳播和擴(kuò)散有著重要的意義。在實(shí)驗(yàn)室中靜脈注射途徑是一種比較廣為使用的辦法，同時(shí)有人還采用肝內(nèi)接種的辦法，這兩種感染途徑都可以獲得很好的感染效果。但在自然情況下HEV會(huì)以哪種途徑進(jìn)行相互感染呢？有研究表明［26］，“糞－口”傳播是一種重要的方式，而通過(guò)“針頭”和扁桃體進(jìn)行傳播的可能性則較小。另有試驗(yàn)指出，當(dāng)豬口服含有適量病毒的膽汁時(shí)，可以使部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染病毒，更重要的是還可以使與之直接接觸的“哨兵”動(dòng)物感染［27］。以上這些信息提示我們，做好糞便清理工作和及時(shí)隔離疑似動(dòng)物，對(duì)做好HEV的防控尤為重要。

4 小結(jié)

豬HEV是一種發(fā)現(xiàn)比較晚的病原，盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期的研究，但仍留給我們較多的空白，例如主要抗原表位的分布、免疫機(jī)制與致病機(jī)制的具體途徑等。開(kāi)展豬HEV研究最重要的原因是，該病原可以在多種動(dòng)物之間傳播［28］，尤其是可能跨宿主感染人類(lèi)，并在一些人群中出現(xiàn)高水平的致死率。預(yù)防該病原在人豬之間以及人與其他動(dòng)物之間相互傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是控制傳染源并切斷傳播途徑。研究表明，帶毒動(dòng)物可以通過(guò)糞便污染水源及水生生物，進(jìn)一步傳播給人類(lèi)。因此，如何加強(qiáng)動(dòng)物糞便的管理，如何提高水質(zhì)監(jiān)測(cè)水平，以及如何避免食品源性動(dòng)物受到病毒的污染，對(duì)今后的研究和監(jiān)管都顯得格外重要。由于豬感染HEV較少發(fā)病，因此豬HEV疫苗的研究始終沒(méi)有明顯的進(jìn)展，但可喜的是人HEV疫苗研究已經(jīng)進(jìn)入了3期臨床試驗(yàn)階段，并取得了很好的效果［29］。在器官移植研究中有人嘗試使用豬的器官替代人的器官，因此豬HEV給異源器官移植同樣帶來(lái)了潛在的危險(xiǎn)。但隨著HEV診斷技術(shù)的不斷優(yōu)化、傳播途徑不斷明確以及相關(guān)疫苗的研發(fā)，我們有理由相信，HEV在不同種屬動(dòng)物之間的傳播會(huì)得到有效的控制，豬HEV在公共衛(wèi)生、食品安全以及器官移植等領(lǐng)域帶來(lái)的問(wèn)題會(huì)得到合理的解決。

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