肝康復合劑的化學成分研究

張進才， 陳光英， 韓長日， 陳文豪， 陸景莉， 平媛媛

(海南師范大學“省部共建－熱帶藥用植物化學”教育部重點實驗室，化學與化工學院，海南海口 571158)

肝康復合劑是海南省定安地區(qū)廣傳于民間的經(jīng)驗方，由火炭母、大青和盤上芫茜組成，民間用于治療急性黃疸型肝炎，具有退黃保肝功效。采用α－萘異硫氰酸酯 (ANIT)灌胃給藥建立小鼠實驗性黃疸模型，以小鼠血清總膽紅素 (TBIL)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)水平為指標，并以茵梔黃顆粒為陽性對照，觀察75%乙醇提取物及不同極性提取部位 (石油醚提取物、三氯甲烷提取物和水提取物)對小鼠血清TBIL和ALT的影響，評價其退黃保肝作用。結(jié)果表明:75%乙醇粗提取物和三氯甲烷部位對ANIT所致小鼠實驗性黃疸模型具有較好的退黃保肝作用。此結(jié)果表明該方對治療急性黃疸型肝炎有較顯著的效果［1］。為了闡明該方的藥效物質(zhì)基礎，本實驗對該方的化學成分進行了初步研究。

1 儀器和材料

XT5—10顯微熔點測定儀 (溫度未校正);Bruker AV—400 MHz超導核磁共振儀 (瑞士Bruker公司);Agilent HCT—1200液質(zhì)聯(lián)用儀;2695型高效液相色譜儀 (Waters分析儀器有限公司);EZ Purifier中低壓制備色譜 (上海利穗化工科技有限公司);正相硅膠 (青島海洋化工廠);Sephadex LH—20(美國Pharmacia公司);C18反相硅膠填料(YMC公司)。所用試劑均為分析純。

火炭母、大青、盤上芫茜于2009年采于海南省定安縣，經(jīng)海南師范大學生命科學學院鐘瓊芯副教授鑒定分別為蓼科蓼屬植物火炭母Polygonum chinenseLinn.的葉、馬鞭草科大青屬植物大青Clerodendron cyrtophyllumTurcz的根、傘形科天胡荽屬植物天胡荽Hydrocotyle sibthorpioidesLam.全草。標本保存于海南師范大學省部共建－熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室。

2 提取與分離

按肝康復合劑處方比例稱取各藥材共10 kg，用75%乙醇浸泡，加熱回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮，得黑色浸膏。浸膏用水溶解后用等體積的石油醚、三氯甲烷反復多次萃取。萃取液減壓濃縮得石油醚部位104 g，三氯甲烷部位145 g。三氯甲烷部位萃取物經(jīng)常壓硅膠色譜柱層析，依次用石油醚－乙酸乙酯 (50∶1→1∶1，V/V)和三氯甲烷－甲醇 (50∶1→1∶1，V/V)進行梯度洗脫，得到A～G共7個組分。組分A經(jīng)石油醚－乙酸乙酯 (45∶1→1∶1，V/V)，得到A1～A55個組分，組分A1經(jīng)析出后得到化合物2(150 mg);組分A4經(jīng)石油醚－三氯甲烷 (3∶1，V/V)洗脫，得到化合物3(380 mg)、4(5.3mg)、5(4 mg);組分B中重結(jié)晶得到大量無色細針狀結(jié)晶得到化合物1(1.5g);組分C經(jīng)三氯甲烷－乙酸乙酯 (45∶1→1∶1，V/V)，得到C1～C33個組分，C2經(jīng)三氯甲烷－丙酮 (15∶1，V/V)洗脫，再經(jīng)制備薄層色譜純化得到化合物6(10 mg);C3經(jīng)三氯甲烷－丙酮(15∶1，V/V)洗脫，經(jīng)半制備HPLC得到化合物7(13 mg)、8(5 mg)、9(4 mg);組分E通過硅膠柱層析，以三氯甲烷－甲醇體系梯度洗脫 (50∶1→1∶1，V/V)，再經(jīng)半制備HPLC得到化合物10(185 mg)、11(5 mg)、12(70 mg);組分G通過制備HPLC(甲醇－水，70∶30)制備分離，經(jīng)葡聚糖凝膠LH－20(洗脫劑:甲醇)純化，得到化合物13(3 mg)、14(3 mg)、15(5 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色針狀結(jié)晶，mp 140～142℃，5%硫酸－乙醇溶液顯色為紫紅色，TLC上多種溶劑系統(tǒng)展開時化合物與對照品β－谷甾醇的Rf值相同，混和后熔點不下降，故鑒定為β－谷甾醇。

化合物2:白色絮狀粉末，mp 63～64℃，ESI－MSm/z255 ［M－H］－。1H－NMR(400MHz，CDCl3)δ:2.34(2H，t，J=7.2 Hz，H－2)，1.63(2H，pent，J=6.8Hz，H－3)，1.25(24H，brs)，0.88(3H，t，J=7.2 Hz，H－16)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:180.1(C－1)，34.2(C－2)，24.7(C－3)，29.1(C－4)，29.4(C－5)，29.5(C－6)，29.6(C－7)，29.7(C－8)，29.7(C－9)，29.7(C－10)，29.7(C－11)，29.7(C－12)，29.3(C－13)，32.0(C－14)，22.7(C－15)，14.1(C－16)。以上數(shù)據(jù)與文獻［2］報道一致，故鑒定化合物2為棕櫚酸 (palmic acid)。

化合物3:白色固體粉末，ESI－MSm/z415［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:0.82(3H，d，J=6.4 Hz，H－27)，0.85(3H，s，H－18)，0.99(3H，d，J=6.4 Hz，H－19)，1.07(3H，s，H－21)，5.38(1H，d，H－6)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:37.9(C－1)，32.5(C－2)，72.4(C－3)，43.1(C－4)，142.3(C－5)，122.3(C－6)，33.2(C－7)，32.3(C－8)，51.7(C－9)，37.9(C－10)，22.0(C－11)，41.0(C－12)，41.5(C－13)，57.8(C－14)，32.8(C－15)，82.3(C－16)，63.8(C－17)，16.8(C－18)，19.9(C－19)，43.0(C－20)，14.9(C－21)，110.6(C－22)，31.5(C－23)，29.9(C－24)，30.9(C－25)，67.9(C－26)，17.5(C－27)。以上數(shù)據(jù)與文獻［3］報道一致，故鑒定化合物3為薯蕷皂苷元。

化合物4:白色晶體，mp 316～318℃，ESIMSm/z455 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:4.69(1H，d，J=2.0 Hz，29－CH2)，4.56(1H，d，J=2.0 Hz，29－CH2)，3.16(1H，dd，J=7.2，9.2 Hz，H－3)，1.63(3H，s，30－CH3)，0.93(3H，s，27－CH3)，0.87(6H，s，23，26 －CH3)，0.76(3H，s，25－CH3)，0.65(3H，s，24－CH3)。13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:38.2(C－1)，27.8(C－2)，77.4(C－3)，38.9(C－4)，55.5(C－5)，18.6(C－6)，34.6(C－7)，39.1(C－8)，50.6(C－9)，37.4(C－10)，21.1(C－11)，25.7(C－12)，37.0(C－13)，42.6(C－14)，27.8(C－15)，29.8(C－16)，47.2(C－17)，49.7(C－18)，49.2(C－19)，152.0(C－20)，30.8(C－21)，32.4(C－22)，28.7(C－23)，15.0(C－24)，16.4(C－25)， 16.6(C－26)， 14.7(C－27)，173.2(C－28)，110.2(C－29)，19.6(C－30)。以上數(shù)據(jù)與文獻［4］報道基本一致，故鑒定化合物4為樺木酸。

化合物5:棕黃色粉末，mp 283～285℃，ESI－MSm/z455 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:0.72(3H，s，H－26)，0.81(3H，s，H－25)，0.84(3H，d，J=7.0 Hz，H－29)，1.11(3H，s，H－27)，1.06(3H，s，H－23)，1.05(3H，s，H－24)，5.22(1H，d，J=7.0 Hz，H－12)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:30.5(C－1)，26.8(C－2)，77.4(C－3)，48.9(C－4)，55.5(C－5)，18.5(C－6)，34.6(C－7)，47.6(C－8)，36.4(C－10)，23.1(C－11)，125.8(C－12)，137.0(C－13)，42.6(C－14)，30.8(C－15)，34.8(C－16)，47.7(C－18)，53.2(C－19)，39.2(C－20)，30.9(C－21)，36.4(C－22)，28.8(C－23)，15.0(C－24)，16.4(C－25)，22.7(C－26)，180.2(C－27)，17.9(C－29)，21.7(C－30)。以上數(shù)據(jù)與文獻［5］報道一致，故鑒定化合物5為烏蘇酸。

化合物6:白色長針狀結(jié)晶，mp 118～120℃，ESI－MSm/z411 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CDCl3)δ:5.73(1H，s，H－4)，1.20(3H，s，H－19)，0.93(3H，d，J=6.5 Hz，H－21)，0.86(3H，t，J=7.5 Hz，H－29)，0.84(3H，d，J=8.0 Hz，H－26)，0.82(3H，d，J=7.0 Hz，H－27)，0.73(3H，s，H－18)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:35.6(C－1)，33.3(C－2)，199.5(C－3)，123.6(C－4)，171.5(C－5)，33.7(C－6)，32.4(C－7)，35.6(C－8)，53.2(C－9)，38.5(C－10)，21.0(C－11)，39.4(C－12)，42.7(C－13)，55.8(C－14)，24.3(C－15)，28.1(C－16)，56.1(C－17)，11.9(C－18)，17.3(C－19)，36.3(C－20)，18.7(C－21)，33.8(C－22)，26.4(C－23)，45.3(C－24)，23.0(C－25)，19.8(C－26)，29.3(C－27)，19.0(C－28)，11.7(C－29)。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物 6 為豆甾－4－烯－3－酮。

化合物 7:白色塊狀固體，ESI－MSm/z321［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:2.55(3H，s，H－15)，3.76(1H，t，J=11.2 Hz，H－6)，3.85(1H，m，H－6α)，4.33(1H，dd，J=11.2，4.4 Hz，H－6')，5.85(1H，d，J=7.6 Hz，H－11α)，6.29(1H，d，J=2 Hz，H－4)，6.53(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H－2)，7.23(1H，d，J=8.4 Hz，H－8)，7.36(1H，d，J=8.4 Hz，H－1)，7.56(1H，d，J=8.4 Hz，H－7)，7.90(1H，s，H－12)，9.74(1H，s，C－3－OH)。13CNMR(100 MHz，DMSO－d6) δ:132.2(C－1)，111.2(C－1a)，109.8(C－2)，158.9(C－3)，102.9(C－4)，156.6(C－4a)，66.0(C－6)，39.3(C－6a)，124.8(C－7)，120.9(C－7a)，103.8(C－8)，153.6(C－9)，112.2(C－10)，156.7(C－10a)，79.8(C－11a)，110.9(C－12)，151.8(C－13)，187.5(C－14)，26.2(C－15)。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］報道一致，故鑒定化合物 7為crotafuran B。

化合物8:淺棕色結(jié)晶，mp 72～75℃，ESIMSm/z148 ［M－H］－。1H－NMR (400MHz，CDCl3)δ:9.77(1H，s，－CHO)，7.77(2H，d，J=8.8 Hz，H－2，6)，6.75(2H，d，J=8.8 Hz，H－3，5)，3.12(6H，s，－N(CH3)2)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:125.3(C－1)，132.0(C－2，C－6)，111.2(C－3， C－5)，154.3(C－4)，190.4(－CHO)，40.2 ［－N(CH3)2］。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］報道一致，故鑒定化合物8為4－二甲氨基苯甲醛。

化合物9:淺黃色晶體，mp 297～298℃，ESI－MSm/z271 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，acetone－d6) δ:13.02(1H， s， 5－OH)， 8.15(1H，s，H－2)，7.45(2H，dd，J=8.4，2.8 Hz，H－2'，6')，6.89(2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H－3'，5')，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H－8)，6.28(1H，d，J=2.0 Hz，H－6)。13C－NMR(100MH，acetone－d6) δ:154.1(C－2)， 122.9(C－3)，181.5(C－4)，163.8(C－5)，99.8(C－6)，165.2(C－7)，94.4(C－8)，105.9(C－4α)，159.0(C－8α)，123.0(C－1')，131.9(C－2')，115.9(C－3')，158.3(C－4')，115.9(C－5')，131.1(C－6')。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物9為染料木素。

化合物10:白色固體粉末，ESI－MSm/z356［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.91(1H，d，J=8.4 Hz，H－4)，6.89(1H，d，J=8.4Hz， H－1)，6.76(1H， s， H－11)，6.65(1H，s，H－12)，4.29(1H，d，J=16 Hz，H－14)，3.92(3H，s，9－OCH3)，3.90(3H，s，10－OCH3)，3.88(6H， s，2，3－OCH3)，3.60(2H，m，H－8)，2.90(1H，m， H－5)，2.66(2H，m，H－6)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:108.7(C－1)， 147.7(C－2)， 147.6(C－3)，111.5(C－4)，29.9(C－5)，51.5(C－7)，53.9(C－8)，127.8(C－8α)，150.4(C－9)，145.2(C－10)， 111.2(C－11)， 123.9(C－12)， 59.3(C14)，55.9(C－2－OCH3)，55.9(C－3－ OCH3)，60.2(C－9－OCH3)，56.2(C－10－OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］報道一致，故鑒定化合物10為tetrahydropalmatine。

化合物11:白色針晶，mp 80～81℃，ESI－MSm/z151 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.77(1H，s，－CHO)，7.40(1H，dd，J=8.1，1.8 Hz，H－6)，7.38(1H，d，J=1.8 Hz，H－2)，6.99(1H，d，J=8.1 Hz，H－5)，3.90(3H，s，－OCH3)。13C－NMR(100 MHz，CDCl3)δ:129.9(C－1)，108.8(C－2)，147.2(C－3)，151.7(C－4)， 114.4(C－5)， 127.6(C－6)， 190.9(－CHO)，56.4(－OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］報道基本一致，故鑒定化合物11為香草醛。

化合物12:淺黃色結(jié)晶粉末，mp 208～210℃，ESI－MSm/z167 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:9.85(1H，s，－COOH)，7.46(1H，dd，J=8.1，1.8 Hz，H－6)，7.45(1H，d，J=1.8 Hz，H－2)，7.08(1H，d，J=8.1 Hz，H－5)，3.99(3H， s，－OCH3)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:123.1(C－1)，113.8(C－2)，152.6(C－3)， 148.6(C－4)， 115.8(C－5)，125.3(C－6)，170.1(－COOH)，56.4(－OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］報道一致，故鑒定化合物12為香草酸。

化合物13:橙色晶狀固體，mp 256～257℃，EMS－MSm/z271 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.58(1H，s，H－4)，7.18(1H，d，J=2.4 Hz，H－5)，7.11(1H，s，H－2)，6.54(1H，d，J=2.4 Hz，H－7)，2.46(3H，s，3－CH3)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD) δ:161.2(C－1)，123.8(C－2)，148.2(C－3)，120.0(C－4)，132.8(C－4α)，108.7(C－5)，134.6(C－5α)，165.5(C－6)，107.9(C－7)，164.5(C－8)，108.3(C－8α)，189.6(C－9)，181.2(C－10)，21.3(3－CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物13為大黃素。

化合物14:白色粉末，mp 96～98℃。ESI－MSm/z285 ［M－H］－。1H－NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.26(2H， d，J=8.4Hz， H－3'，5')，7.02(2H，d，J=8.4 Hz，H－2'，6')，4.48(2H，s，H－4')，5.03(1H，d，J=7.6 Hz，H－1)，3.82(1H，dd，J=7.6，2.0 Hz，H－2)，3.46(1H，m，H－3)，3.39(1H，m，H－4)，3.65(1H，m，H－5)，3.52(2H，m，H－6)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD) δ:156.4(C－1)，116.6(C－2，6)，129.2(C－3，5)，134.9(C－4)，63.3(－CH2OH)，100.1(C－1')，75.5(C－2')，72.9(C－3')，69.4(C－4')，76.1(C－5')，60.5(C－6')。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物14為天麻素。

化合物15:白色晶狀粉末，mp 223～226℃，ESI－MSm/z391 ［M+H］+。1H－NMR(400 MHz，CD3OD) δ:7.10(2H，d，J=8.4 Hz，H－2'，6')，6.67(2H，d，J=8.4 Hz，H－3'，5')，6.41(2H，s，H－2，4)，6.48(1H，s，H－6)，6.36(1H，d，J=12.0 Hz，H－7)，6.52(1H，d，J=12.0 Hz，H－8)。13C－NMR(100 MHz，CD3OD)δ:141.1(C－1)， 109.2(C－2)， 160.1(C－3)，103.9(C－4)， 159.5(C－5)， 111.1(C－6)，129.9(C－1')，131.4(C－2'，6')，116.2(C－3'，5')，158.0(C－4')，102.3(C－1″)，74.9(C－2″)，78.0(C－3″)，71.1(C－4″)，77.8(C－5″)，62.2(C－6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物15為云杉新苷。

4 討論

肝炎已成為嚴重危害人類健康的大敵。盡管目前治療肝炎的藥物較多，然而能夠達到令人滿意療效的藥物較少。中藥不僅有著來源廣泛、種類及數(shù)量眾多、毒副反應小的特點，而且有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點綜合作用的特點，在治療肝病方面有著獨特的優(yōu)勢。從傳統(tǒng)的中藥中尋找有效部位或有效成分治療病毒性肝炎已成為研究的熱點［16］。本實驗從肝康復合劑的三氯甲烷部位中分離得到15個化合物，據(jù)文獻報道，樺木酸具有抗腫瘤作用和保肝作用［17］，烏蘇酸具有抗炎保肝作用［18］，大黃素具有抗病毒作用和保肝作用［19］，云杉新苷具有降血脂作用和退黃保肝作用［20］，據(jù)此推測這幾個化合物是該復方的活性成分，也初步驗證本課題的合理性。但對于肝康復合劑中起退黃保肝作用的有效成分具體是什么，其藥理作用機制如何，將有待于進一步深入研究。

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