β-防御素的研究進展

魏洪濤 王國珍 李 慧 李金成 (吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院口腔科，吉林 長春 30033)

生物界中各物種對致病微生物的入侵均具有效的防御機制，這除了與后天產(chǎn)生的適應性免疫系統(tǒng)有關外，還與機體產(chǎn)生的抗微生物多肽和蛋白(APs)密切相關，APs包括防御素、過氧化物酶、溶菌酶、磷脂酶等多種不同分子量、不同組成的多肽和蛋白，是宿主先天性防御體系的重要組成成分〔1〕。其中防御素(defensins)是近年來頗受關注的一組抗微生物多肽。防御素具廣譜抗微生物活性，能有效地殺滅病毒、細菌、真菌、螺旋體等，對腫瘤細胞也有細胞毒作用，且迄今尚未發(fā)現(xiàn)有致病菌株對其產(chǎn)生耐藥性，因此人們把防御素看作是一個對付細菌耐藥的突破口而對其投入了較大的關注，其中最為引人注目的是β-防御素〔2〕。

1 防御素概述

防御素最早是1980年Lehrer首次從兔肺巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)的，以后在許多動物的上皮細胞、腸的Paneth細胞、中性粒細胞、及人的扁桃體〔3〕分離和檢測到了防御素分子。防御素是一類富含半胱氨酸、精氨酸的陽離子抗微生物多肽，防御素分子一般由28～54個氨基酸組成，含有6～8個半胱氨酸殘基，分子內(nèi)有3～4個二硫鍵，分子量4～6 KD左右。哺乳動物的防御素分子一般含有29～42個氨基酸。防御素具有3個共同特點:小分子量(＜4 000)、帶陽離子電荷、活性作用局限于細胞膜。防御素的分類和分布根據(jù)防御素的來源、分子結(jié)構特征、表達部位的不同，將防御素分為哺乳動物防御素、昆蟲防御素、植物防御素，α-防御素、β-防御素等。

依據(jù)其半胱氨酸的空間位置和二硫鍵連接次序不同，人類防御素可分為α-防御素、β-防御素兩個亞家族，是抵抗病原微生物入侵的第一道天然防線〔4〕。α-防御素含29～35個氨基酸殘基，α-防御素分子鏈內(nèi)二硫鍵連接位置分別為Cys1-Cys6，Cys2-Cys4，Cys3-Cys5。其中Cys1-Cys6連接N端和 C端，形成分子大環(huán)。目前其家族已有6個成員:4種人類中性粒細胞防御素(HNP)1～4，是中性粒細胞中嗜苯胺藍顆粒的主要成分，是吞噬細胞非依賴氧殺菌機制的重要組成部分;HNP-5、6分布于小腸Paneth細胞和女性生殖道上皮。

β-防御素是1991年Diamond等首次在牛的氣管黏膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn)該類短肽，后來在牛中性粒細胞中也分離出13種。1995年 Bensch等〔5〕首次從腎衰病人血液透析液中發(fā)現(xiàn)HBD-1，后又在胃腸道、泌尿生殖道和口腔上皮等組織檢測到，呈固有性表達;2000年Harder等〔6〕從銀屑病病損皮膚中發(fā)現(xiàn)了HBD-2、3，HBD-2也存在于呼吸道、胃腸道、口腔上皮等組織，皮膚、扁桃體是HBD-3表達的主要組織，兩者是β-防御素中在轉(zhuǎn)錄水平上受炎癥刺激物調(diào)節(jié)的成員，呈誘導性表達;HBD-4僅局限表達于幾種組織如睪丸、胃竇等，細菌感染和聚丙烯酸甲酯(PMA)增強其表達而腫瘤壞死因子-α(TNF-α)則不能使其表達增加〔7〕。

2 β-防御素的分子生物學特征

2.1 分子結(jié)構 人β-防御素HBD-1、HBD-2、HBD-3及HBD-4分別為36個氨基酸、65個氨基酸、45個氨基酸和72個氨基酸的短肽，其分子中都帶有較多的正電荷，空間結(jié)構分為疏水區(qū)和帶電區(qū)，肽鏈折疊形成三束β片層結(jié)構。與α-防御素比較兩者半胱氨酸殘基在氨基酸列中的位置、定位以及它們的肽鏈折疊和二硫鍵模式等都完全不同。β-防御素前體由93～95個氨基酸組成，包括信號肽、原片段和成熟肽3個部分。肽鏈折疊形成三束β片層結(jié)構，由6個半胱氨酸殘基形成三個二硫鍵穩(wěn)定其結(jié)構，分子中均富含精氨酸;此外，其分子中還有4個保守的甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和賴氨酸殘基。HBD-3的氨基酸序列與HBD-2的約有43%的同源性。HBD-4與HBD-1、HBD-2和HBD-3只有20%～25%的氨基酸同源序列。

2.2 基因結(jié)構和定位 β-防御素的基因位于人染色體8p22～23區(qū)＜1 m的范圍內(nèi)，有兩個外顯子，一個內(nèi)含子。成熟的HBD-1由36個氨基酸組成，基因大小約為7.0 kb，第一外顯子編碼β-防御素前體的信號肽和原片段，第二外顯子編碼成熟肽。由于它的基因序列中沒有核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)和活化蛋白(AP-1)的作用元件，因此不被炎癥因子誘導上調(diào)，而是生理性表達在上皮細胞中〔8〕。HBD-2與 HBD-1的基因位點相距500～600 bp。HBD-2基因的片段相對較小，其內(nèi)含子僅為1.6 kb，兩個外顯子分別為81 bp和238 bp。HBD-2基因中有四個同轉(zhuǎn)錄因子NF-κB相結(jié)合的序列，因而推測HBD-2是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族NF-κB的靶基因產(chǎn)物。HBD-3位于HBD-2上游，二者相距13 kb。HBD-3的基因序列編碼67個氨基酸組成的多肽，其中與HBD-2具有43%的同源性。HBD-4基因的兩個外顯子被一個約4.5 kb的內(nèi)含子所分隔，第一外顯子編碼大部分信號肽序列，信號肽的剩余部分加原片段和成熟肽則由第二外顯子所編碼。HBD 1～4基因均位于8 p 22～23.2區(qū)域。

2.3 β-防御素的表達 β-防御素表達有兩種方式，分別為結(jié)構性表達(constitutive expression)和誘導性表達(induced expression)。HBD-1在正常組織中持續(xù)表達，在炎癥刺激下及致炎因子存在的情況下，HBD-1表達量無明顯增加，故認為HBD-1為固有表達，而HBD-2、HBD-3、HBD-4能分別被細菌因子和致炎因子誘導表達。HBD-2基因表達可通過致炎因子誘導如TNF、白細胞介素(IL-1)、LPS，細菌如酵母菌、脂多糖誘導表達。β-防御素還受作用環(huán)境的鹽濃度、pH值的影響。HBD-3在生理鹽水中，其活性不受影響，而HBD-4當NaCl濃度從0增至25 mmol/L，抑制葡球菌TM300的能力減少4倍。防御素在高濃度鹽水下抗微生物活性被抑制，可能因為抑制了帶正電的防御素結(jié)合到帶負電的細菌表面，影響防御素的殺菌效力的發(fā)揮。

3 β-防御素的生物活性

3.1 抗微生物活性 β-防御素具有廣譜抗微生物活性，可以有效地殺滅革蘭陰性、革蘭陽性菌。但就人的β-防御素而言，主要殺滅革蘭陰性菌，如大腸桿菌、假單胞綠膿桿菌。而對革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌的殺滅作用不強。HBD-2對革蘭陰性菌，革蘭陽性菌、酵母菌均有較強殺傷作用，尤其對革蘭陰性菌有高效殺菌作用，在約10μg/ml濃度下就可以達到90%的殺菌效果。微克級水平的HBD-3對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及酵母菌都有強烈殺傷作用，HBD-3相對于其他防御素對鹽濃度不敏感，但對多藥抗藥性的金黃色葡萄球菌和抗萬古霉素的糞腸球菌也可在較低濃度下發(fā)揮殺傷作用。HBD-4是一種內(nèi)源性鹽依賴性抗微生物肽，可抑制革蘭陽性菌、革蘭陰性菌如大腸桿菌及釀酒酵母，且與其他抗生素及溶菌酶具有協(xié)同作用。

目前的研究表明防御素的殺菌活性來源于它對細菌陰離子質(zhì)脂雙分子層的穿透(包括細菌的內(nèi)膜和外膜)，并在細胞膜上形成直徑約20 A的孔洞，使細菌內(nèi)的成分釋放出來，以此來殺滅細菌。由于β-防御素帶正電荷，能夠與帶負電荷、呈陰性的細菌表面結(jié)合，結(jié)合后其分子中的疏水區(qū)可插入到細菌的胞膜，而其帶電區(qū)(帶正電荷)則與細胞膜上帶負電荷的磷脂頭部以及水分子相互作用。在細胞膜上多個β-防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內(nèi)，而胞內(nèi)重要的鹽類、大分子等則泄漏到胞外，造成物質(zhì)泄漏，最終導致不可逆性的菌體死亡。

3.2 免疫活性及作用機制 β-防御素作為機體防御性物質(zhì)參與天然免疫應答，不僅具有對病原體的直接殺傷作用，還具有化學趨化作用以及與其他蛋白酶(如溶菌酶)的協(xié)同作用。在感染的局部，β-防御素被大量誘導表達和釋放，對病原微生物造成直接的殺傷作用發(fā)揮其趨化活性到達感染組織局部以清除入侵的病原微生物〔9〕。β-防御素就可以激活巨噬細胞、樹突狀細胞，從而激活獲得性免疫系統(tǒng)，因此，β-防御素具有聯(lián)系先天性免疫和獲得性免疫的作用。β-防御素可能有一個或多個具有七次跨膜結(jié)構域的受體，或者是受體耦聯(lián)著Gia蛋白。對脂多糖(LPS)誘導HBD-2表達進而啟動機體固有免疫的信號途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)LPS需要一種CD14依賴途徑啟動人支氣管上皮(HTBE)細胞使之合成和分泌HBD-2，并最終激活NF-κB，發(fā)揮其生物學作用〔10〕。由此可見，β-防御素在機體抗微生物入侵的固有性免疫和獲得性免疫中均具有重要作用。除此之外，由于腎上腺類固醇激素具有免疫抑制作用，防御素作為信號分子的功能也許可以解釋其在濃度很低而不能直接殺死致病微生物時產(chǎn)生的生物學效應。

3.3 細胞毒性作用 防御素的細胞毒性活力是不依賴氧的機制溶解靶細胞的。防御素可以損傷真核細胞，如腫瘤細胞和人的中性粒細胞。在體外，防御素可以抑制還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性。防御素的細胞毒活性部分依賴于靶細胞膜的脂質(zhì)組成和在靶細胞上的代謝活性。此外，過氧化氫酶可以與HNP協(xié)同作用來誘導細胞毒活性。在急性炎癥病灶中，中性粒細胞積聚在其周圍，釋放防御素，在殺滅微生物的同時，還非特異性地損傷了周圍一些正常細胞，這種作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴特性，并且可被組織中的血漿蛋白滅活。這與防御素遇到清蛋白或血清時，其抗病毒活性大大減弱的情形有些相似。人防御素無腫瘤細胞特異性，可溶解人淋巴細胞、多形核白細胞、內(nèi)皮細胞以及小鼠的胸腺細胞和脾細胞，防御素參與機體的抗腫瘤免疫活動，具有抗腫瘤細胞特性〔11〕，其抗腫瘤作用主要通過抑制氧化酶的活性，與過氧化氫酶有協(xié)同作用，并部分依賴于靶細胞膜的脂質(zhì)成分而實現(xiàn)。

4 應用前景

4.1 解決細菌耐藥問題 細菌對抗生素的耐藥性是當今臨床醫(yī)學面臨的全球性難題，防御素對于病原微生物的作用機理，使病原微生物不易對其產(chǎn)生抗性，與其他抗微生物肽相比具有無可比擬的優(yōu)勢，由于防御素之間和防御素與抗生素之間存在協(xié)同作用，可以聯(lián)合應用幾種防御素和抗生素來取得更好的治療效果，或者利用其誘導表達的特性，設計藥物來特異地誘導靶器官的防御素表達從而達到治療目的。因防御素對有包膜病毒(流感病毒、艾滋病病毒等)的殺傷作用，有望應用于病毒感染性疾病、尤其是AIDS這一世界性難題的防治〔12〕。

天然獲取防御素的量極其有限，而防御素分子內(nèi)含有3對二硫鍵，化學合成的多肽難以保證正確配對，影響其生物活性;通過基因工程技術生產(chǎn)防御素，由于該分子的抗菌活性，面臨防御素引起工程菌“自殺”的難題，給基因工程表達帶來了一定困難。

4.2 在抗腫瘤方面的應用 晚期腫瘤傳統(tǒng)的治療方法是放療或化療，然而無論是放療或化療都不可避免地會造成造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的損害，對免疫系統(tǒng)造成進一步的打擊，并且不能完全清除殘存的腫瘤細胞，防御素主要通過損傷細胞骨架而對腫瘤細胞有殺傷作用，同時防御素不會對細胞及免疫系統(tǒng)造成損害，這無疑是人類征服腫瘤的道路上的一大福音，為腫瘤的治療提供了新途徑。

4.3 防御素在基因工程方面的應用與研究 雖然β-防御素在黏膜防御中的重要性已得到確認，但在自然條件下防御素的表達水平極低或不表達，需要經(jīng)微生物、前炎癥細胞因子誘導才能表達，難以通過直接分離純化大量獲得。而利用基因工程技術的方法來生產(chǎn)防御素是降低成本的一條有效途徑，可通過基因工程手段大量生產(chǎn)防御素，使其能夠得到廣泛利用。將不同來源的蛋白質(zhì)以一定的方式連接，形成一種新型、雜合蛋白質(zhì)的技術即蛋白融合技術在防御素基因工程中得到了重視，將通過人工合成或蛋白酶酶切獲得的幾個不同來源的肽段相互連接，獲得不同蛋白質(zhì)之間的融合體，可獲得協(xié)同效應。目前研究多致力于尋找高效的表達載體系統(tǒng)?？刮⑸镫幕虮磉_的研究最初是在原核表達系統(tǒng)中進行的，但由于抗微生物肽對細菌的殺傷作用及原核表達缺乏酰氨化功能，因此抗微生物肽基因只能以融合蛋白形式表達。近十年基因工程被用于生產(chǎn)小陽離子肽。E.coli因其較快的生長速度和已確定的表達體系在基因工程中常被用作宿主細胞。然而，將E.coli作為HBD-2宿主細胞尚有兩個主要問題需要解決，包括HBD-2的抗革蘭氏陰性細菌活性和小肽段易被蛋白水解酶降解。以上問題可通過選擇低蛋白酶活性的E.coli菌株及利用選擇的質(zhì)粒以抑制HBD-2的抗革蘭氏陰性細菌活性來克服。此外，在細胞培養(yǎng)過程中細胞生長和產(chǎn)物表達可被分成不同的階段。

多種防御素已在不同的表達體系中得到表達。Cabral等〔13〕將豌豆防御素(rPsdl)與釀酒酵母匹配因子α(Fα1)的分泌信號序列構建能在華赤酵母屬中表達的載體，分泌表達出63.0 mg/L重組防御素培養(yǎng)基，并且rPsdl對黑曲霉菌有活性。在對人類尖銳濕疣的研究中，利用RT-PCR的方法進行HBD-2基因克隆。融合形式是用于表達型載體構建以避免宿主細胞的毒性作用，制成表達型載體并轉(zhuǎn)染至E.coli中HBD-2以融合蛋白的形式表達。這些提示可進行HBD-2轉(zhuǎn)染至E.coli中克隆表達〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，一種特殊的質(zhì)粒pIVEX2.4c-trxA-shBD2構成了融合蛋白(HBD-2與His-Tag和Trx-Tag相連接)的無細胞表達系統(tǒng)可以增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性并使其后的提純過程更加易行〔15〕。通過優(yōu)化反應條件，目標融合蛋白的重要部分綜合于生物反應器中。

今后防御素基因工程的研究工作應注意以下幾個方面:①提高轉(zhuǎn)基因防御素的生物學活性，使其在抗微生物方面能發(fā)揮越來越多的作用;②解決基因沉默問題，并進一步提高目的基因的表達水平和遺傳穩(wěn)定性;③建立生物反應器，大量生產(chǎn)并提純防御素蛋白，在保持防御素生物學活性的條件下提純防御素蛋白;合成抗微生物活力更強、抗微生物范圍更廣的防御素，是值得深入研究的問題。

1 Hao HN，Zhao J，Lotoczky G，et al.Induction of human beta-defensin-2 expression in human astrocytes by lipopolysaccharide and cytokines〔J〕.J Neurochem，2001，77(4):1027-35.

2 Alekseeva L，Huet D，F(xiàn)éménia F，et al.Inducible expression of beta defensins by human respiratory epithelial cells exposed to Aspergillus fumigatus organisms〔J〕.BMC Microbiol，2009，9(1):33.

3 Chae SO，Lee SH，Cho JH，et al.Expression of human beta-defensin 1 mRNA in human palatine tonsil〔J〕.Acta Otolaryngol，2001，121(3):414-8.

4 Zou G，Leeuw E，Lubkowski J，et al.Molecular determinants for the interaction of human neutrophilα defensin 1 with its propeptide〔J〕.JMol Biol，2008;381(5):1281-91.

5 Bensch KW，Raida M，Magert HG，et al.hbd-1:a novel beta-defensin from human plasma〔J〕.FEBSLett，1995;368(2):331-5.

6 Harder J，Bartels J，Christophers E，et al.Isolation and characterization of human beta-defensin-3，a novel human inducible peptide antibiotic〔J〕.J Biol Chem，2001;276(8):5707-13.

7 Garcia JR，Krause A，Schulz S，et al.Human beta-defensin-4:a novel inducible peptide with a specific salt-sensitive spectrum of antimicrobial activity〔J〕.FASEB J，2001;15(10):1819-21.

8 Li K，Dan Z，Hu X，et al.CD14 overexpression upregulates TNF-α-mediated inflammatory responses and suppresses the malignancy of gastric carcinoma cells〔J〕.Mol Cell Biochem，2013;376(1-2):137-43.

9 Yang D，Chertov O，Bykovskaia SN，et al.Beta-defensin:linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6〔J〕.Science，1999;286(5439):525-8.

10 Becker MN，Diamond G，Verghese MW，et al.CD14-dependent lipopoly saccharide inducedβ-defensin-2 expression in human tracheobronchial epithelium〔J〕.J Biol Chem，2000;275(38):29731-6.

11 Mizukawa N，Sugiyama K，Kamio M，et al.Immunohistochemical staining of human alpha-defensin-1(HNP-1)，in the submandibular glands of patients with oral carcinomas〔J〕.Anticancer Res，2000;20(28):1125-7.

12 Zhang L，Yu W，He T，et al.Contribution of human alpha-defensin 1，2，and 3 to the anti-HIV-1 activity of CD8 antiviral Factor〔J〕.Science，2002;298(5602):995-1000.

13 Cabral KM，Almeida MS，Valente AP，et al.Production of the active antifungal Pisum sativum defensin-1(Psd 1)in Pichia pastoris:overcoming the inefficiency of the STE13 protease〔J〕.Protein Exp Purif，2003，31(1):115-22.

14 Krisanaprakornkit S，Jotikasthira D，Dale BA.Intracellular calciumin signaling human beta-defensin-2 expression in oral epithelial cells〔J〕.JDent Res，2003;82(11):877-82.

15 Chen H，Xu Z，Xu N，et al.Efficient production of a soluble fusion protein containing human beta-defensin-2 in E.coli cell-free system〔J〕.J Biotechnol，2005;115(3):307-15.