糖尿病腎病與硫氧還蛋白及其相互作用蛋白關(guān)系的研究進(jìn)展

方曉琳 郭蔚瑩 劉 青 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 3002)

隨著人們生活行為，飲食結(jié)構(gòu)及人口老齡化的改變，糖尿病(DM)的發(fā)病率與日劇增，成為嚴(yán)重威脅人類健康的慢性代謝性疾病，據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2000年全球有DM患者約1.51億，而估計(jì)到2030年全球?qū)?億人患DM，DM是DM腎病(DN)重要的微血管并發(fā)癥之一，臨床上一旦產(chǎn)生，其腎臟損害不可逆進(jìn)展，比例約占40% ～50%〔1，2〕，是歐美國(guó)家導(dǎo)致腎臟尿毒癥期最重要原因之一，其病理上表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，引起腎小球纖維化、硬化，引起腎小球高濾過(guò)及蛋白尿，也稱為DN腎小球硬化癥。其發(fā)病機(jī)制仍未闡明，目前，關(guān)于DN的氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)倍受關(guān)注，有DM動(dòng)物模型顯示硫氧還蛋白相互作用蛋白通過(guò)降低硫氧還蛋白活性是血管氧化損傷的一個(gè)重要機(jī)制〔3〕，調(diào)節(jié)兩者的活性有可能成為新的藥理靶點(diǎn)。

1 氧化應(yīng)激與DN

近來(lái)國(guó)內(nèi)外大量研究表明氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機(jī)制中起了重要的作用，人們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激標(biāo)記物丙二醛(MDA)在DM患者血清中明顯增多，而機(jī)體中重要抗氧化酶即超氧化物歧化酶(SOD)明顯下降，表明氧化應(yīng)激參與其發(fā)病發(fā)展。Brownlee〔4〕曾提出參與DM并發(fā)癥的多元醇途徑，糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation and products，AGEs)途徑，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑及氨基己糖途徑均是氧化應(yīng)激的結(jié)果，產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)參與DM狀態(tài)下腎細(xì)胞損傷，腎小球血流動(dòng)力學(xué)變化及腎臟細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracelular matrix protein，ECM)〔5〕代謝。為了中止氧化應(yīng)激的潛在損傷作用，哺乳動(dòng)物細(xì)胞有一個(gè)廣泛的抗氧化系統(tǒng)序列清除ROS，修復(fù)氧化分子，同時(shí)把難以修復(fù)的損傷靶點(diǎn)降解，其中Trx系統(tǒng)對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡作用巨大。

Trx、Txnip在腎臟的定位與表達(dá):國(guó)際放射雜交基因定位協(xié)會(huì)將人的Txnip基因定位于染色體1q21-23區(qū)，而DM基因位于人染色體1q21-24區(qū)，家族性混合型高脂血癥基因位于染色體1q21-23區(qū)，顯示了高度的同源性，Andvani等〔6〕通過(guò)研究鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DM雌性轉(zhuǎn)基因R(TGR，mRen-2)27大鼠和DN患者腎臟中Txnip與Trx的表達(dá)及定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TxnipmRNA及其蛋白在腎小管及遠(yuǎn)端腎單位中大量表達(dá)，相反，TrxmRNA及其表達(dá)蛋白局限于皮質(zhì)，內(nèi)側(cè)帶多于外側(cè)帶，并在皮質(zhì)所有結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)。

2 Trx對(duì)抗氧化應(yīng)激

Trx是一種分子量約12 kD的小分子蛋白，廣泛存在于原核，真核生物細(xì)胞中，與Trx還原酶，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)共同組成一個(gè)廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶-Trx系統(tǒng)，該系統(tǒng)與谷氧還蛋白以及谷胱甘肽系統(tǒng)均為機(jī)體普遍表達(dá)的巰基還原系統(tǒng)，還原型的Trx通過(guò)與含二硫鍵的氧化型蛋白相互作用后，其內(nèi)部形成一個(gè)新的二硫鍵，該二硫鍵反過(guò)來(lái)可被TrxR和NADPH還原，還原型Trx在被TrxR作用的過(guò)程中清除了像H2O2，MDA等ROS〔7〕。多項(xiàng)研究表明，Trx參與多種細(xì)胞發(fā)育進(jìn)化過(guò)程，如氧化增殖，細(xì)胞凋亡，基因表達(dá)以及血脂和血糖代謝，生物力學(xué)，神經(jīng)保護(hù)等，發(fā)揮的多重作用〔8〕。人體的Trx主要包括胞漿型(Trx-1)及線粒體型(Trx-2)，由于對(duì)Trx-1研究多，本文中主要指Trx-1。

Trx-1是由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的基因，Billiet等〔9〕近期研究指出，單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-a)特殊的啟動(dòng)子GW647可以上調(diào)Trx基因表達(dá)，而同種細(xì)胞中PPAR-r的特殊啟動(dòng)子GW929起到的下調(diào)作用，王云〔10〕研究觀察到PPAR-a激動(dòng)劑非諾貝特可以上調(diào)DM大鼠主動(dòng)脈組織中Trx mRNA表達(dá)水平，提示PPARet激動(dòng)劑對(duì)心血管的保護(hù)效應(yīng)是通過(guò)上調(diào)Tr x-1的基因表達(dá)，從而影響Trx介導(dǎo)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄活性，以發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抑制炎癥因子生成的作用〔11〕。

Trx-1的抗氧化作用主要包括以下兩個(gè)方面〔12〕:①Trx-1直接或作為某些過(guò)氧化物酶的電子供體清除活性氧，從而降低脂質(zhì)過(guò)氧化，DNA損傷及蛋白質(zhì)的失活。②Trx-1通過(guò)二硫鍵能還原多種蛋白質(zhì)(包括:激酶，磷酸激酶和轉(zhuǎn)錄因子等)，從而使其恢復(fù)生理功能，是維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要因素，氧化應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞可以通過(guò)上調(diào)Trx-1，代償性維持生理功能。Trx-1與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Kakisaka等〔13〕通過(guò)ELISA方法檢測(cè)DM患者體內(nèi)Trx-1水平相對(duì)于正常人群組明顯上升，且血漿內(nèi)Trx-1的含量可以反映2型糖尿病患者體內(nèi)胰島素抵抗的水平。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)胞外Trx與糖尿病的關(guān)系〔14〕:糖耐量減低與Trx的水平相關(guān)，在糖耐量減低患者血漿中Trx的含量與健康人群相比出現(xiàn)顯著偏高。以上研究表明Trx-1是DM患者氧化損傷的生物標(biāo)記物，且可能存在DM導(dǎo)致氧化損傷的代償反應(yīng)。胰腺細(xì)胞Trx-1過(guò)表達(dá)的小鼠患DM的概率明顯降低，這是由于Trx-1抑制免疫反應(yīng)導(dǎo)致的B細(xì)胞凋亡〔15〕，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)參與B細(xì)胞凋亡的過(guò)程，重組Trx可以保護(hù)細(xì)胞免受由腫瘤壞死因子(TNF)和抗FasL系統(tǒng)參與B細(xì)胞凋亡的過(guò)程，并且Trx能與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶結(jié)合，抑制凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)活性以及p38MAPK活性，鈍化細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，從而保護(hù)了細(xì)胞免于凋亡〔16〕，在DN模型中，Trx過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠與正常對(duì)照小鼠相比，腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)增和微管損傷都顯著減輕，蛋白尿減少，這表明Trx具有抑制DM腎損傷作用〔17〕，由此推測(cè)增加Trx表達(dá)對(duì)DN的防治具有重要意義。

3 Txnip介導(dǎo)氧化應(yīng)激

Txnip是一個(gè)分子量約46 000 D的蛋白質(zhì)，也被稱作Trx結(jié)合蛋白2(TBP-2)及維生素D3上調(diào)蛋白(VDVP-1)，人們最初在用1，25-二羥維生素D3治療的白血病細(xì)胞(HL-60)中發(fā)現(xiàn)了Txnip，此后〔18〕，人們用酵母雙雜交系統(tǒng)分離了Txnip，并認(rèn)為它是Trx結(jié)合蛋白，近來(lái)其受到重視，首先因?yàn)門xnip基因被視為重要的抑癌基因之一，能作為抗癌藥物的新靶點(diǎn)〔19〕，而后發(fā)現(xiàn)其與葡萄糖〔20〕和脂肪〔21〕代謝密切相關(guān)，Patwari等〔22〕發(fā)現(xiàn)了Txnip與硫氧還蛋白(TRX)通過(guò)巰基交換形成一個(gè)穩(wěn)定的含二硫鍵復(fù)合物，并發(fā)現(xiàn)了2個(gè)對(duì)此作用過(guò)程十分重要的Txnip半胱氨酸殘基-Txnip247和63位半胱氨酸殘基。

3.1 高滲糖誘導(dǎo)Txnip表達(dá) Fang等〔22〕為探討小鼠系膜中高滲糖誘導(dǎo)Txnip表達(dá)的信號(hào)通路，結(jié)果顯示，Txnip在高滲糖環(huán)境4～12 h和12～24 h表達(dá)明顯高于對(duì)照組，并且N-乙酰半胱氨酸在高滲糖環(huán)境下降低Txnip表達(dá)，更進(jìn)一步研究表明，p38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)抑制劑SB239063及SB203580，MEK抑制劑U0126在高滲糖環(huán)境下明顯抑制其表達(dá)，Txnip mRNA及其蛋白水平的表達(dá)是通過(guò)ROS/MAPK/MEK信號(hào)通路，Ren等〔23〕同樣證實(shí)了P38MAPK通路誘導(dǎo)高滲糖環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞中Txnip的表達(dá)，以上研究表明高血糖能夠誘導(dǎo)Txnip的表達(dá)，且高滲糖暴露時(shí)間與Txnip基因的表達(dá)成正相關(guān)，而阻斷其信號(hào)通路明顯抑制Txnip表達(dá)。

3.2 Txnip調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞中膠原蛋白的表達(dá) Price等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，在DM大鼠的神經(jīng)組織中，基因芯片分析12 w之內(nèi)Txnip均有高表達(dá)，特別是在DM模型4 w時(shí)，神經(jīng)組織中Txnip高表達(dá)最明顯，且Txnip的改變是引起DN的一個(gè)早期因素。Qi等〔25〕報(bào)道，在雌性 Homozygous 27 DM 大鼠8 w時(shí)，腎小管中Txnip表達(dá)增高。腎小球系膜細(xì)胞的病理改變?cè)贒N的發(fā)病中起關(guān)鍵的作用，持續(xù)Txnip的超表達(dá)促進(jìn)腎小球系膜ECM基因表達(dá)，促進(jìn)DN的發(fā)病，Kobayashi等〔26〕檢測(cè)高滲糖刺激培養(yǎng)的人的系膜細(xì)胞基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)S73591(Txnip)基因的表達(dá)在高糖濃度各組中明顯升高2倍以上，另一方面，COL4A1基因表達(dá)在高糖環(huán)境下被迅速誘導(dǎo)且作用持久，過(guò)多表達(dá)的VDVP-1基因處于Ⅳ型膠原蛋白a1 chainCOL4A1 mRNA表達(dá)上游，最終導(dǎo)致Ⅳ型膠原蛋白的沉積，而Ⅳ型膠原蛋白是ECM的主要成分之一，Inoue等〔27〕等發(fā)現(xiàn)尿膠原Ⅳ蛋白的濃度隨著腎病的進(jìn)展而增加，且與健康對(duì)照組比較，蛋白尿陰性的2型DM(T2DM)患者尿膠原Ⅳ蛋白的濃度亦顯著增加，說(shuō)明尿膠原Ⅳ蛋白對(duì)監(jiān)測(cè)早期DN具有重要意義，上述研究表明Txnip可能通過(guò)調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)促進(jìn)DN的產(chǎn)生及進(jìn)展。Chen等〔28〕通過(guò)研究小鼠胰島細(xì)胞在25 mmol/L糖濃度中培養(yǎng)24 h后Txnip升高了18倍，同時(shí)伴有胰島細(xì)胞的持續(xù)凋亡，過(guò)多的Txnip介導(dǎo)了內(nèi)源性線粒體途徑的凋亡，相反，Txnip基因敲除的HCB-19小鼠對(duì)抗高血糖引起的B細(xì)胞凋亡，說(shuō)明了Txnip在糖毒性和B細(xì)胞凋亡中起的關(guān)鍵的作用，其結(jié)果均將導(dǎo)致高血糖，惡化腎臟所處的內(nèi)環(huán)境。有研究認(rèn)為Txnip的表達(dá)依賴TGF-β1的上調(diào)，TGF-β1增強(qiáng)通過(guò)影響ECM代謝而推進(jìn)DN腎臟的肥大及硬化，與此不同的是，Qi等〔25〕通過(guò)小分子干擾RNA(siRNA)將TGF-β1基因沉默，但其Txnip的活性仍升高。

4 展望

林海玲等〔29〕通過(guò)免疫組化，RT-PCR，Western免疫印跡技術(shù)觀察Trx系統(tǒng)在T2DM大鼠腎臟組織的表達(dá)及早期普羅布考干預(yù)對(duì)Trx系統(tǒng)表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普羅布考治療組與DM非治療組比較，Trx表達(dá)升高，Txnip表達(dá)降低，說(shuō)明普羅布考通過(guò)部分恢復(fù)Trx功能，降低Txnip表達(dá)發(fā)揮對(duì)T2DM大鼠腎臟組織的抗氧化作用。有些研究顯示〔30〕艾塞那肽可降低Txnip基因表達(dá)抑制B細(xì)胞凋亡，Trx可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)B細(xì)胞及腎臟具有保護(hù)作用，而Txnip的過(guò)度表達(dá)介導(dǎo)組織細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激。Trx及Txnip對(duì)監(jiān)測(cè)DN進(jìn)展具有一定的潛力，需要進(jìn)一步證實(shí)，如何抑制Txnip基因表達(dá)，開(kāi)發(fā)其抑制劑或Trx激動(dòng)劑，可能成為DN治療的又一熱點(diǎn)。

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