自噬對(duì)衰老的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展

郭亞男 劉 青 (吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春 3002)

人口的老齡化將成為21世紀(jì)人類社會(huì)面臨的重要問題之一，一些發(fā)達(dá)國家的人均年齡有望超過80歲且有繼續(xù)增長的趨勢(shì)〔1〕。隨著人口的逐漸老齡化，探索衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)及其相關(guān)的分子學(xué)機(jī)制成為現(xiàn)在科學(xué)研究的一個(gè)重要課題。最新的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)不斷積累的受損的大分子物質(zhì)及細(xì)胞器是引起多種真核生物衰老的“激動(dòng)劑”，并導(dǎo)致它們的生存能力下降〔2〕。而自噬是真核細(xì)胞中一種重要的分解代謝過程，可以降解細(xì)胞中受損的大分子物質(zhì)及細(xì)胞器，并可使之再循環(huán)成為細(xì)胞所需的能量及基本物質(zhì)〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)幾乎在所有細(xì)胞及組織中，自噬水平的減低與生物體的衰老表型有著密切的聯(lián)系，并會(huì)引起衰老相關(guān)疾病的進(jìn)一步加重〔4〕。這些研究都證明自噬對(duì)衰老的生理及病理過程有著重要的調(diào)節(jié)作用。

1 自噬與AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路

自噬(autophagy)，即自我吞噬作用(autophagoeytosis)，是存在于真核生物細(xì)胞中的一種高度保守的、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的重要保護(hù)性機(jī)制。在生理情況下，細(xì)胞的自噬功能保持在一個(gè)較低的基礎(chǔ)水平，可通過清除細(xì)胞內(nèi)少量受損的細(xì)胞器(如線粒體等)和生物大分子(如蛋白質(zhì))，維持細(xì)胞正常的生理功能。但是，在某些應(yīng)激情況下(例如，營養(yǎng)缺乏、缺血等)，細(xì)胞的自噬活性可明顯上調(diào)，細(xì)胞可降解自身成分，釋放出游離氨基酸和脂肪酸等降解成分，用于補(bǔ)充能量缺乏和生物大分子的合成以便維持細(xì)胞的生存〔5〕。

在營養(yǎng)缺乏的條件下，自噬作用可以使胞質(zhì)中的物質(zhì)循環(huán)利用，用來生物合成或產(chǎn)生能量，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)自噬在生物的生命活動(dòng)中起著復(fù)雜的作用，除了能量限制外還有很多種干預(yù)手段可以啟動(dòng)自噬，另外自噬過程中自噬體所吞噬的物質(zhì)是有選擇性的。第一個(gè)被確認(rèn)的是自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene，ATG1)，這個(gè)基因可以編碼蛋白激酶復(fù)合物中的催化亞基從而激活自噬〔6〕。在酵母菌自噬特異性蛋白ATG1與ATG13以復(fù)合物的形式對(duì)自噬起著重要的作用，在哺乳動(dòng)物中，自噬特異性蛋白ATG1的同源體分別為(uncoordinated 51-like kinase 1，ULK1)和 ULK2，其中ULK1通過與ATG13及FIP200的復(fù)合物發(fā)揮作用，同時(shí)受到哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的負(fù)性調(diào)控〔7〕。近期研究表明在哺乳動(dòng)物中能量缺乏可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-actived protein kinase，AMPK)而直接使 ULK1磷酸化，從而激活自噬〔8，9〕。

AMPK被普遍認(rèn)為是細(xì)胞能量狀態(tài)的感受器，受ATP/ADP的調(diào)控〔10〕。研究過程中發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬和AMPK同時(shí)被激活，于是很多實(shí)驗(yàn)開始研究這兩者之間的關(guān)系。然而最初對(duì)肝臟的研究中得到的結(jié)果與人們預(yù)期的相反，AMPK的特異性激活劑5-氨基-4-氨甲咪唑核苷(AICAR)抑制了自噬〔11〕。接著在后來一系列關(guān)于酵母菌的研究中進(jìn)一步證明了AMPK與自噬的關(guān)系〔12〕。酵母菌通過空泡(即哺乳動(dòng)物的溶酶體)儲(chǔ)藏糖原，只有在十分饑餓時(shí)為酵母菌提供能量，也為酵母菌苞芽的形成提供能量基礎(chǔ)，當(dāng)自噬功能減弱時(shí)會(huì)引起酵母菌長期的糖原積累障礙。蔗糖非酵解相關(guān)激因(SNF1)基因(編碼酵母菌中AMPK同源體的基因)的突變，在引起酵母菌一系列缺陷的同時(shí)，主要減少了糖原的積累，在此條件下提高ATG1與ATG13這兩種基因的表達(dá)增強(qiáng)了糖原的積累，這證明了SNF1/AMPK對(duì)自噬起到正向調(diào)控的作用。Wang等〔12〕證明了在酵母菌中SNF1/AMPK在調(diào)節(jié)自噬功能和糖原積累中是ATG1/ATG13的上游。

最早發(fā)現(xiàn)AMPK是通過對(duì)雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體(mTORC1)的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的調(diào)控的。mTOR通路普遍存在于酵母菌和哺乳動(dòng)物中，被公認(rèn)為對(duì)自噬起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，用TORC1阻斷劑雷帕霉素阻斷該通路可以增強(qiáng)自噬作用〔13〕。AMPK通過兩條獨(dú)立的通路對(duì)TORC1進(jìn)行調(diào)節(jié)，一是AMPK可以激活 TORC1上游的(the tuberous sclerosis complex 2，TSC2)的磷酸化，從而使(Ras homolog enriched in brain，Rheb)的GTP磷酸水解酶滅活，達(dá)到抑制 TORC1的作用〔14〕。而在TSC2敲除的酵母菌中，AMPK通過磷酸化TORC1復(fù)合物中的Raptor亞基從而使14-3-3蛋白積累，抑制了mTOR的活性〔15〕。由此發(fā)現(xiàn)AMPK通過mTOR通路對(duì)自噬的調(diào)控在哺乳動(dòng)物和酵母菌中是不同的。

最近研究〔9，16，17〕發(fā)現(xiàn)了新的 AMPK 調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬功能的分子機(jī)制，把AMPK與ULK1聯(lián)系起來，Egan等通過生物學(xué)信息方法在AMPK原有序列標(biāo)記位點(diǎn)中找出潛在的AMPK作用底物〔15〕，ULK1作為候選的底物之一，它存在4個(gè)與AMPK反應(yīng)的位點(diǎn)。苯乙雙胍(AMPK激活劑)刺激的細(xì)胞通過質(zhì)譜分析，鑒定出三個(gè)磷酸化位點(diǎn):S555、T574和S637，通過磷酸化抗體鑒定出S467這個(gè)位點(diǎn)。Kim等〔17〕發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以通過無糖培養(yǎng)(饑餓狀態(tài))可以激活并磷酸化ULK1，AMPK阻斷劑(Compound C)可以阻斷這一過程。這些科學(xué)家通過系統(tǒng)突變和體外磷酸化反應(yīng)鑒定ULK1的磷酸化位點(diǎn)，最終發(fā)現(xiàn)兩個(gè)AMPK磷酸化的重要位點(diǎn):S317和S777。同時(shí)有研究〔16〕證明AMPK是通過它的γ亞基與ULK1發(fā)生相互作用的，同時(shí)驗(yàn)證了AMPK可以在體外磷酸化ULK1。由上述研究可以得出通過建立營養(yǎng)物質(zhì)缺乏(低糖環(huán)境)模型，可以激活哺乳動(dòng)物的AMPK，從而使自噬中重要的始動(dòng)因子ULK1發(fā)生磷酸化。

盡管現(xiàn)在以得出饑餓和AMPK可以激活ULK1的結(jié)論，但具體機(jī)制仍有爭(zhēng)議。其中AMPK對(duì)ULK1的磷酸化位點(diǎn)是一個(gè)爭(zhēng)議的焦點(diǎn)。Kim等〔17〕認(rèn)為Shaw所證明的S555及T574不是AMPK的作用位點(diǎn)。而Shang等〔18〕用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸培養(yǎng)細(xì)胞及質(zhì)譜分析，報(bào)道了人類細(xì)胞的ULK1有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而這13個(gè)位點(diǎn)中不包括Kim等〔17〕發(fā)現(xiàn)的S555和S637(人類細(xì)胞中的位點(diǎn)是S556和S638)，但是該研究認(rèn)為營養(yǎng)缺乏引起了大量ULK1的去磷酸化，其中S638與S758是兩個(gè)重要的去磷酸化位點(diǎn)，而Kim等〔17〕人認(rèn)為這兩個(gè)位點(diǎn)是mTOR的磷酸化位點(diǎn)，在營養(yǎng)缺乏的條件下TORC1的活性被抑制，這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸水平降低。Kim等認(rèn)為在營養(yǎng)缺乏的條件下磷酸化作用阻斷了AMPK的結(jié)合，所以要恢復(fù)AMPK水平必須使mTOR的活性降低。而Shang等〔18〕認(rèn)為在營養(yǎng)缺乏條件下ULK1的S758位點(diǎn)的去磷酸化作用使得AMPK與ULK1分離從而激活ULK1。

總的來說，通過AMPK、mTORC1、ULK1之間的相互作用調(diào)控哺乳動(dòng)物的自噬功能是肯定的。但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究，尤其是ULK1的磷酸化及它與AMPK之間的相互作用機(jī)制。通過以上的討論可以發(fā)現(xiàn)在不同的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)條件下存在多種自噬調(diào)控途徑。ULK1是一種大分子蛋白質(zhì)，有著豐富的絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，盡管現(xiàn)在有一些先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，但弄清這些位點(diǎn)的作用仍是一件巨大的工程。但值得肯定的是在高等真核生物中會(huì)有越來越多關(guān)于AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路與自噬的研究。

2 抑制自噬功能引起衰老的過早出現(xiàn)

很多研究報(bào)道ATG蛋白質(zhì)類或其他自噬相關(guān)蛋白例如Sirtuin1在衰老組織中的表達(dá)降低，并且隨著衰老的進(jìn)展自噬作用逐漸減退。在正常老年人的腦組織中ATG5、ATG7和Beclin1的表達(dá)減少〔19〕，而在有胰島素抵抗和代謝綜合征的老年人腦組織的Sirtuin1的表達(dá)減少〔20〕，在患有骨關(guān)節(jié)炎的老年人腦組織中 ULK1、Beclin、微管相關(guān)蛋白(LC3)的表達(dá)下調(diào)〔21〕。同樣的肌醇三磷酸(IP3)受體信號(hào)通路在衰老相關(guān)疾病(神經(jīng)性退化疾病、心臟肥大等)時(shí)被激活，再次說明了自噬作用的降低與衰老有著密切的關(guān)系〔22〕。雖然只有現(xiàn)象學(xué)的觀察，但這些研究已經(jīng)表明自噬的減弱可能造成衰老的過早出現(xiàn)。

不管在酵母菌還是在哺乳類動(dòng)物中通過外在干預(yù)下調(diào)自噬都會(huì)引起衰老的過早出現(xiàn)及壽命的縮短。在有關(guān)線蟲的研究中〔23〕，ATG1/ULK1、ATG7、ATG18 及 Beclin 等基因失去功能的突變，會(huì)引起線蟲壽命的縮短。同樣的ATG1、ATG8及Sestrin1的表達(dá)缺陷會(huì)縮短果蠅的壽命〔24〕。敲除關(guān)鍵的ATG蛋白質(zhì)類對(duì)于剛出生的小鼠來說是致命，因?yàn)樽允蓪?duì)小鼠從孕育到斷奶過程中細(xì)胞內(nèi)能量的儲(chǔ)備活動(dòng)的作用是必不可少的〔25〕。組織特異性敲除ATG基因較少引起明顯的表型改變，而是引起各種衰老相關(guān)的特異性沉淀物(脂褐素、受損的線粒體等)的明顯增加。

一些研究〔26〕證明通過改善衰老相關(guān)的自噬缺陷可以影響衰老相關(guān)的表型，在衰老小鼠的肝臟亮氨酸酸性核蛋白2a(LAMP2a)表達(dá)水平降低，而通過建立LAMP2a轉(zhuǎn)基因小鼠模型提高LAMP2a的表達(dá)水平，這些轉(zhuǎn)基因小鼠較同齡野生型小鼠年輕，這一作用是通過恢復(fù)LAMP2a的正常水平的表達(dá)從而避免衰老相關(guān)的分子伴侶介導(dǎo)的自噬和大分子自噬作用衰減，同時(shí)還減弱了肝臟中氧化產(chǎn)物、泛素化蛋白聚集物、凋亡細(xì)胞的積累〔26〕。在肥胖、糖尿病、高脂飲食、先天性瘦素缺乏時(shí)肝臟的自噬功能也會(huì)減弱。在肝臟細(xì)胞中通過干預(yù)高表達(dá)ATG7，可以增強(qiáng)肝臟細(xì)胞的自噬作用，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，中和胰島素抵抗。這些研究都證明了衰老與自噬功能的不足有著密切的聯(lián)系。

3 增強(qiáng)自噬延緩衰老、延長壽命

最早在對(duì)線蟲的研究中證明通過抑制胰島素樣生長因子信號(hào)通路可以提高自噬作用，同時(shí)延長線蟲的壽命，當(dāng)誘導(dǎo)重要的自噬相關(guān)基因突變時(shí)，即使抑制了胰島素樣生長因子通路仍不能延長線蟲的壽命〔27〕。熱量限制(減少食物的攝入但不引起營養(yǎng)不良)，在抗衰老及延長壽命中所起的重要作用已經(jīng)在對(duì)各種動(dòng)物的研究中得到肯定，包括在對(duì)恒河猴的研究〔28〕中發(fā)現(xiàn)熱量限制可以減少糖尿病、心血管疾病、腫瘤、腦萎縮的發(fā)病率。流行病學(xué)調(diào)查研究〔25〕熱量限制對(duì)人類的健康也是有益的，而且通過控制食物攝入干預(yù)自噬功能是一種非常符合生理的手段。熱量限制對(duì)自噬的調(diào)控主要是通過AMPK、SIRT1這兩個(gè)能量感受因子實(shí)現(xiàn)的。另外熱量限制還可以通過對(duì)胰島素類生長因子信號(hào)通路及mTOR同路的抑制從而增強(qiáng)自噬作用。

不管在對(duì)酵母菌還是果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)mTOR通路已經(jīng)被抑制時(shí)，熱量限制將不再延長它們的壽命，這些研究進(jìn)一步證明了熱量限制是通過mTOR信號(hào)通路來調(diào)控自噬和衰老的。而mTOR對(duì)衰老的調(diào)控是通過對(duì)其下游的核糖體蛋白激酶(S6K)或起始因子4E結(jié)合蛋白(4EBP)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)過表達(dá)有活性的S6K時(shí)，即使用雷帕霉素抑制mTOR也不能起到延緩衰老的作用〔29〕。S6K表達(dá)的缺失會(huì)引起AMPK的激活從而增強(qiáng)自噬延緩衰老，在對(duì)AMPK缺失的線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)S6K的缺失并不能延長線蟲的壽命〔30〕。

4 展望與小結(jié)

隨著社會(huì)人口的老齡化，人們對(duì)衰老及衰老相關(guān)性疾病日益重視。對(duì)衰老的研究由生物水平延伸至分子水平，而自噬作為衰老過程中一種重要的調(diào)節(jié)機(jī)制也備受關(guān)注。由上面的各種研究我們得出AMPK、mTOR在自噬與衰老中都起著關(guān)鍵的作用，這兩種分子物質(zhì)使得自噬功能與衰老的調(diào)控發(fā)生了一系列密切的關(guān)系，而且在許多研究中已經(jīng)證明了增強(qiáng)自噬可以延緩衰老及增長壽命，但其中的機(jī)制尚未完全清楚，尤其是對(duì)AMPK、mTOR作用底物的研究尚存在很多爭(zhēng)議，進(jìn)一步弄清這些機(jī)制對(duì)明確自噬與衰老的關(guān)系，尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)，從而達(dá)到延緩衰老及預(yù)防衰老相關(guān)疾病的發(fā)生有著重要的意義。

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