李 韜 趙金偉 葛巨剛 李晨玉 (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 300)
循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CSC)是指自發(fā)或因醫(yī)療操作等人為因素進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。具有高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中生存下來(lái),相互聚集形成微小癌栓,并在一定條件下發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶,因此,檢測(cè)外周血中腫瘤細(xì)胞可以預(yù)警腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究采用RT-PCR技術(shù)分析外周血基因標(biāo)記物mRNA表達(dá)與癌性腸梗阻肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
1.1 材料 收集吉林省人民醫(yī)院及吉林省腫瘤醫(yī)院2009年3月至2010年5月經(jīng)X線和(或)腹部CT確診的27例結(jié)腸梗阻病例,年齡68~82〔平均(75.3±6.7)〕歲,均經(jīng)手術(shù)治療,術(shù)中及術(shù)后確立診斷。20例為結(jié)直腸癌所致腸梗阻,7例為非癌性腸梗阻,20例癌性腸梗阻中有14例伴發(fā)肝臟轉(zhuǎn)移。抽取靜脈血5~10 ml放置于-80℃冰箱冰凍保存,備用。
1.2 外周血標(biāo)本的預(yù)處理 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)采用聚蔗糖-泛影葡胺梯度離心法,分離吸出白膜狀界面細(xì)胞層,依次洗滌,離心后獲得PBMC,置于-80℃冰箱中保存。
1.3 總RNA提取 用焦碳酸二乙酯(DEPC)嚴(yán)格處理實(shí)驗(yàn)器材以防RNA酶污染。解凍組織標(biāo)本或糞便預(yù)處理后的標(biāo)本,研磨后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,1 000 r/min,5 min,棄上清;加1 ml Trizol,室溫放置5 min,轉(zhuǎn)到EP管加0.2 ml氯仿重懸沉淀,劇烈振搖,室溫靜置5 min;4℃12 000 r/min,離心15 min;上層水相移至另一EP管,加入0.5 ml冰異丙醇充分混勻,室溫放置 10 min,4℃ 12 000 r/min,離心 15 min,去上清,加入75%冰乙醇-DEPC 1 ml,振搖洗滌沉淀,4℃ 12 000 r/min,離心10 min,棄上清;去乙醇,空氣中干燥 RNA,加DEPC水10~50 μl,溶解RNA,所得的總RNA置于-80℃冰箱保存。
1.4 RNA純度及完整性檢測(cè) 取RNA樣品用紫外-可見光分光光度計(jì)于260 nm、280 nm處測(cè)定A值,計(jì)算RNA濃度和RNA定量。取RNA樣品進(jìn)行甲醛變性,1%瓊脂糖凝膠電泳,拍照,用光密度掃描儀掃描28 s和18 s條帶,計(jì)算密度比值。
1.5 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)所需引物及內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物均系上海生工生物工程公司合成,經(jīng)GenBank檢索為特異性引物〔1〕。DNA Marker采用寶生物工程有限公司 DL2000 Marker。(1)逆轉(zhuǎn)錄:RNA 4 μl+OligodT 2 μl+DEPC 10 μl,72℃,5 min,變性模板 RNA,迅速放置冰上,復(fù)性模板 RNA。5倍緩沖液 5 μl+10 mmol/L dNTP 2 μl+25 U/μl Rnasin 1 μl+200 U/μl MMLV 1 μl,42℃,1 h,94℃,5 min,放于冰上,5 min,置-80℃儲(chǔ)存。(2)PCR反應(yīng)體系:滅菌去離子水 32 μl,10 × PCR 緩沖液 5 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,10 pmol 上游 引物 1 μl,10 pmol 下游 引物 1 μl,cDNA(0.1 μg/μl)1 μl,Taq DNA 聚合酶(2 U/μl)0.2 μl。擴(kuò)增條件:β-actin:取 cDNA 2 μl,加入 10 倍緩沖液 2 μl,25 mmol/L 氯化鎂溶液 1.2 μl,Taq 酶1 U,22.5 mmol/L dNTPs 0.16 μl,β-actin引物0.1 μg,加去離子水至20 μl進(jìn)行PCP擴(kuò)增。每次設(shè)一管不加樣品 cDNA為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性 30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共 30 個(gè)循環(huán),72℃延長(zhǎng)7 min。基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.1%溴乙啶)電泳,拍照。環(huán)氧合酶2(COX-2),肌酸激酶(CK-20)及CD44v6:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl,加入10 × PCR 緩沖液3 μl,COX-2 引物 20 pmol,β-actin 引物 4 pmol,Taq DNA 酶1 U,DEPC處理水至30 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min,95℃變性1 min,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,共45個(gè)循環(huán)。基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.1%溴乙啶)電泳,拍照。圖片中出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶為mRNA表達(dá)陽(yáng)性。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件行χ2檢驗(yàn)。
伴肝轉(zhuǎn)移的14例病人中,85.7%(12/14)的病人外周血中至少有一種基因mRNA表達(dá)陽(yáng)性;而在非轉(zhuǎn)移的6例病人中,16.7%(1/6)陽(yáng)性表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003 0)。
聯(lián)合檢測(cè)外周血中COX-2,CK-20及CD44v6 mRNA表達(dá)預(yù)測(cè)肝轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確性分別為85.7%,83.3%,92.3%,71.4%、85.0%。
由于機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和機(jī)械性殺傷作用和腫瘤細(xì)胞自身因素,大多數(shù)進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,不能形成轉(zhuǎn)移灶,這種現(xiàn)象稱之為“無(wú)效轉(zhuǎn)移”〔2〕。只有極少數(shù)具有高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中生存下來(lái),相互聚集形成微小癌栓,并在一定條件下發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶。因此,檢測(cè)外周血中腫瘤細(xì)胞可以預(yù)警腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。RT-PCR技術(shù)被認(rèn)為是目前檢測(cè)最有效的方法,以腫瘤和上皮組織中某些物質(zhì)的mRNA為標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)直腸癌CSC。Kopreski等〔3〕首次采用RT-PCR方法檢測(cè)到黑色素瘤患者血漿中酪氨酸酶的mRNA,結(jié)果證實(shí)RT-PCR方法檢測(cè)外周血CSC mRNA切實(shí)可行。采用RT-PCR及其他各種改進(jìn)的RT-PCR技術(shù),使用不同的標(biāo)記物,可從105~107個(gè)循環(huán)細(xì)胞中檢測(cè)出1個(gè)腫瘤細(xì)胞,常用的標(biāo)記物有端粒酶 mRNA、CK mRNA、CD44v mRNA、EGFR mRNA 等,當(dāng)以單一腫瘤標(biāo)記物的mRNA為標(biāo)記物,易受到假基因的干擾,造成假陽(yáng)性的原因是組織特異性基因在非特異性基因細(xì)胞內(nèi)的非法轉(zhuǎn)錄等,易導(dǎo)致假陰性的原因是循環(huán)腫瘤細(xì)胞間斷釋放入血以及RNA酶降解的特點(diǎn)。Hsieh等〔4〕對(duì)118例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和血清中K-ras、P53及APC基因突變采用PCR-SSCP方法進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)擴(kuò)增的基因組DNA直接測(cè)序檢查。Hibi等〔5〕對(duì)44例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行寡核苷酸錯(cuò)配檢測(cè),確定了血清中DNA的遺傳變異特性,16例腫瘤組織及血標(biāo)本中同樣檢測(cè)到了K-ras基因突變,在腫瘤組織內(nèi)檢測(cè)到P53基因突變的10例患者中,有7例患者血標(biāo)本中也檢測(cè)到了同樣的基因突變,其中5例處于早期病變(P=0.01),23%結(jié)直腸癌患者血清中P53或K-ras基因突變,結(jié)直腸癌早期患者血清出現(xiàn)高比例的P53基因突變提示其可以作為檢測(cè)的標(biāo)記物。Hardingham等〔6〕對(duì)結(jié)直腸癌患者采用PCR檢測(cè)K-ras基因突變,發(fā)現(xiàn)K-ras 12位點(diǎn)突變與生存期和復(fù)發(fā)率相關(guān),突變者生存率降低,復(fù)發(fā)率增加。由于DNA在循環(huán)中較為穩(wěn)定,使用DNA檢測(cè)得到的可能只是循環(huán)內(nèi)的腫瘤負(fù)荷,而不是有活力的腫瘤細(xì)胞,近年來(lái)其應(yīng)用逐漸減少,而以腫瘤或上皮組織特異性mRNA為檢測(cè)對(duì)象的RT-PCR方法近年來(lái)應(yīng)用最為廣泛。Shen等〔7〕通過(guò)比較腫瘤及健康對(duì)照組的CSC檢出率,發(fā)現(xiàn)良性腫瘤組及健康對(duì)照組CSC陽(yáng)性率明顯低于癌癥組。在Dukes A、B期,Dukes C期及Dukes D期三組間CSC陽(yáng)性率差異具有顯著性,且CSC陽(yáng)性率高的患者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。Uen等〔8〕對(duì)行腫瘤根治性手術(shù)患者術(shù)前1 w和術(shù)后1 w外周血CSC進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)術(shù)后 UICC分期 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者陽(yáng)性率分別為6.0%、30.3%和41.3%,而對(duì)應(yīng)的術(shù)后復(fù)發(fā)率分別為2.3%、28.7%和39.7%,且CSC持續(xù)陽(yáng)性提示患者術(shù)后生存期短??傊?,在一般情況下,早期(Ⅰ、Ⅱ期)患者CSC陽(yáng)性率較低,中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)患者陽(yáng)性率較高。RT-PCR檢測(cè)方法與免疫組織化學(xué)法相比敏感度更高〔9〕,而且多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯高于單項(xiàng)指標(biāo),手術(shù)和化療會(huì)使CSC計(jì)數(shù)減少,甚至轉(zhuǎn)陰。
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