Notch信號(hào)通路對(duì)周圍T淋巴細(xì)胞活性及分化的調(diào)控作用①

陳國(guó)慶 綜述 楊 樺 審校 (第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科，重慶400037)

Notch是一種物種間表達(dá)高度保守的跨膜蛋白受體，其在胚胎及出生后個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。Notch首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，因其功能缺失后果蠅翅膀產(chǎn)生缺口而得名。在哺乳動(dòng)物中，Notch受體有4種:Notch1-Notch4，其配體分為Delta like與 Jagged兩類，前者包括 Delta1、Delta3、Delta4或 DLL1、DLL3、DLL4，后者包括 Jagged1 和Jagged2。當(dāng)配體與Notch受體結(jié)合而將其激活后，Notch活性片段進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控Notch靶基因HES家族或HEY家族的表達(dá)。在胸腺和骨髓中，Notch受體的激活可促進(jìn)淋巴前體細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞方向進(jìn)行分化［1，2］。胸腺和骨髓內(nèi)形成的T淋巴細(xì)胞進(jìn)入周圍淋巴組織后，CD4+T淋巴細(xì)胞需在抗原呈遞細(xì)胞所呈遞抗原的刺激下逐漸分化為Th1或Th2效應(yīng)淋巴細(xì)胞，然后參與機(jī)體的抗原特異性免疫反應(yīng)。此前研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞Th1和Th2方向的分化中起著重要作用［3，4］，但近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Notch表達(dá)同樣在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞分化中起重要作用，并調(diào)控其活性。本文就Notch通路及其在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞的活性和兩極分化中的調(diào)控作用作一綜述。

1 Notch信號(hào)通路概述

1．1 CSL參與的Notch經(jīng)典信號(hào)通路 哺乳動(dòng)物Notch受體由N1-N4四個(gè)基因編碼，每一個(gè)基因都合成單獨(dú)的跨膜多肽，新合成的Notch前體蛋白在高爾基體中進(jìn)行加工修飾后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面形成異源二聚體，其中包括細(xì)胞內(nèi)片段和細(xì)胞外片段［5，6］。當(dāng)配體與Notch受體結(jié)合后，Notch受體胞外片段發(fā)生構(gòu)象變化，ADAM金屬蛋白酶切割胞內(nèi)片段使其從細(xì)胞膜表面脫落，脫落的胞內(nèi)片段再經(jīng)過(guò)γ-分泌酶的切割修飾后形成Notch受體的細(xì)胞內(nèi)活性片段NICD(Notch1 intracellular domain，NICD)，并轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核［7，8］。NICD進(jìn)入細(xì)胞核后與核結(jié)合蛋白CSL(CBF1 suppressor of hairless-Lag1，CSL)(小鼠為RBP-J)相結(jié)合并啟動(dòng)靶基因HES的轉(zhuǎn)錄，這是研究較多的經(jīng)典通路［9］。在Notch未被激活的狀態(tài)下，CSL與羧基末端結(jié)合蛋白CTBP1(Carboxy-terminal binding protein 1，CTBP1)等分子組成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻斷Notch靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在CTBP1基因敲除小鼠中，Notch靶基因Hey1表達(dá)即明顯增強(qiáng)［10］。另外，NICD與CSL結(jié)合后，組蛋白乙?；窹300、P300/CBP相關(guān)因子PCAF可進(jìn)一步激活NICD-CSL復(fù)合物，促進(jìn)Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄［11］。

1．2 NF-κB參與的Notch信號(hào)通路 經(jīng)典通路中，Notch受體激活后，其活性片段NICD進(jìn)入細(xì)胞核與CSL(RBP-J)結(jié)合，并啟動(dòng)靶基因HES的轉(zhuǎn)錄。但是，將小鼠RBP-J基因敲除后的研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞Notch受體激活后其分泌IFN-γ仍舊升高明顯，同時(shí)HES1和HES5表達(dá)無(wú)明顯變化。這提示我們，Notch受體激活后有其他的信號(hào)傳導(dǎo)通路［12］。

既往研究已明確，T淋巴細(xì)胞表面TCR受體的激活可促進(jìn)NF-κB的活性;TCR的激活還可促進(jìn)Notch受體的激活，這提示在TCR激活的T淋巴細(xì)胞中 NF-κB和 Notch受體之間可能存在相互作用［13］。近來(lái)研究表明，Notch受體與 NF-κB之間的確存在著密切聯(lián)系。Notch1可以激活NF-κB，并且Notch1可通過(guò)CSL依賴的方式調(diào)控NF-κB抑制劑IκBα 的水平［14，15］。T 淋巴細(xì)胞的 Notch 受體激活后，其活性片段NICD與NF-κB的相互作用促進(jìn)了NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的停留，從而促進(jìn)了 NF-κB與DNA的結(jié)合及其作用的發(fā)揮［16］。在Notch1低表達(dá)的小鼠中，周圍T淋巴細(xì)胞的NF-κB活性降低，IFN-γ 分泌減少［17］;相反，在 Notch3過(guò)表達(dá)小鼠中，胸腺細(xì)胞的NF-κB持續(xù)被激活，可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生［18］。反過(guò)來(lái)，NF-κB 還可以影響Notch信號(hào)通路。T淋巴細(xì)胞中，NF-κB被激活后，其組成之一Rel蛋白可促進(jìn)Notch配體Jagged1的表達(dá)，并促進(jìn) Jagged1與 Notch受體的結(jié)合［19］。這說(shuō)明，Notch受體與NF-κB之間存在相互聯(lián)系。免疫共沉淀研究亦證實(shí)，Notch和NF-κB、NICD和Rel形成復(fù)合物結(jié)合于 IFN-γ編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域［16］。有意義的是，研究證實(shí) CSL 與 NF-κB 在DNA的結(jié)合位點(diǎn)序列有重疊區(qū)域，二者之間可能存在著結(jié)合目的DNA序列的競(jìng)爭(zhēng)性機(jī)制，共同調(diào)控Notch下游靶基因的表達(dá)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究［20］。

2 Notch通路調(diào)控周圍T淋巴細(xì)胞的活性

此前研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路激活后可阻斷促凋亡核受體蛋白Nur77的活性，從而抑制TCR激活后引起的T淋巴細(xì)胞的凋亡［21］。GSK3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)是一種糖原合成酶激酶，Notch受體激活后可促進(jìn)PI3K/AKT通路的激活而磷酸化GSK3β，抑制GSK3β的活性，并促進(jìn)抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡，應(yīng)用Notch受體激活的阻斷劑后細(xì)胞凋亡明顯增多［22］。另一方面，GSK3β是Notch信號(hào)通路的抑制劑，而PI3K/AKT又可通過(guò)GSK3β抑制Notch通路的活性［23，24］。上述研究表明，Notch 信號(hào)通路與 PI3K/AKT通路間存在相互作用，Notch信號(hào)通路激活后具有抑制T淋巴細(xì)胞凋亡的功能，PI3K/AKT通路介導(dǎo)此作用。

T淋巴細(xì)胞表面受體TCR的激活可引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控T淋巴細(xì)胞的活性。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TCR激活后可通過(guò)促進(jìn)Notch受體的激活而影響T淋巴細(xì)胞的活性。激活周圍CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞TCR受體的同時(shí)阻斷Notch受體的激活則抑制了 T淋巴細(xì)胞的增殖及 IFN-γ的分泌［17］。在CD4+T淋巴細(xì)胞中，其CD4分子與Notch受體共定位在細(xì)胞表面，CD4受體激活后促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-10，但阻斷Notch受體激活后IL-10分泌被抑制［25］。與此研究結(jié)果一致的是，脂多糖LPS激活的抗原呈遞細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞的IL-10分泌和CD8+T淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌［26］。腺病毒激活的抗原呈遞細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞Th1和Th2活性，表現(xiàn)為促進(jìn)其IFN-γ、IL-2和IL-4的分泌［27］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體促進(jìn)T淋巴細(xì)胞IL-2分泌的同時(shí)，還可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞表面IL-2受體的表達(dá)，從而參與了 IL-2的正反饋調(diào)控［13］。上述研究提示Notch受體在T淋巴細(xì)胞的活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

3 Notch通路調(diào)控周圍T淋巴細(xì)胞的兩極分化

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體調(diào)控激活的T淋巴細(xì)胞向Th1、Th2或調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞向Tr方向進(jìn)行分化。

3．1 Notch受體調(diào)控T淋巴細(xì)胞的Th1方向分化

研究發(fā)現(xiàn)，DLL1可激活CD4+T淋巴細(xì)胞表面Notch3受體，促進(jìn)激活的CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向進(jìn)行分化［28］。在此研究中，純化的CD4+T淋巴細(xì)胞與DLL1共培養(yǎng)，CD4+T淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌增多、IL-4分泌減少;然后通過(guò)轉(zhuǎn)染的方式使CD4+T淋巴細(xì)胞過(guò)表達(dá)Notch-3后與DLL1共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Notch-3的CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ進(jìn)一步升高。上述結(jié)果表明，DLL1-Notch-3通路促進(jìn)了CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化。T-bet是一種選擇性地表達(dá)于Th1細(xì)胞的新型轉(zhuǎn)錄因子。DLL1與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+T淋巴細(xì)胞的T-bet表達(dá)即明顯升高［3］。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠體內(nèi)注射DLL1，機(jī)體由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的抗寄生蟲的免疫反應(yīng)明確增強(qiáng)［28］。上述研究證實(shí)了Notch受體激活后具有促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向進(jìn)行分化，并促進(jìn)其對(duì)病原體反應(yīng)的功能。

體外研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Notch受體在最初48小時(shí)內(nèi)決定CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向進(jìn)行分化［29］。CD4+T淋巴細(xì)胞在促Th1方向分化的環(huán)境中培養(yǎng)，在48小時(shí)內(nèi)阻斷Notch受體后，CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化失敗，表現(xiàn)為特異性表達(dá)于Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的編碼基因Tbx21不再表達(dá);但是在Notch受體被阻斷的條件下，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染方式使CD4+T淋巴細(xì)胞再次表達(dá)Notch-1受體的激活片段NICD后，Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet的編碼基因Tbx21再次表達(dá);而且研究證實(shí)，NICD、CSL明確結(jié)合于Tbx21基因的啟動(dòng)子區(qū)域，這提示Notch1受體具有調(diào)控T淋巴細(xì)胞向Th1方向進(jìn)行分化的功能。

3．2 Notch受體調(diào)控T淋巴細(xì)胞的Th2方向分化

Notch受體在CD4+T淋巴細(xì)胞的Th2方向分化中同樣起著調(diào)控作用［30，31］。在上文提及的研究中，CD4+T淋巴細(xì)胞與表達(dá)DLL1的抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化，并分泌IFN-γ［28，29］;然而，另有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T 淋巴細(xì)胞與表達(dá)Jagged1的抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化，并分泌IL-4和IL-5;而且，將 CD4+T淋巴細(xì)胞的 RBP-J基因敲除后，CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-4明顯降低，說(shuō)明RBP-J參與了此過(guò)程［30］。在RBP-J基因敲除小鼠的研究支持了上述觀點(diǎn)，RBP-J參與了Notch激活后促進(jìn)IL-4 表達(dá)的通路［32］。

MAML1蛋白是一種促進(jìn)Notch靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄輔激活因子。針對(duì)MAML1基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠周圍T淋巴細(xì)胞發(fā)育正常，且主要表現(xiàn)為Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng);當(dāng)小鼠腸道感染鼠鞭蟲時(shí)，機(jī)體因缺乏Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而不能徹底清除鼠鞭蟲感染［31］。

另有對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的Notch1基因特異性敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Notch1通路不參與CD4+T淋巴細(xì)胞的Th1或Th2方向分化，而且不參與Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但是此研究中未考慮其他Notch 受體的作用［33］。

上述各個(gè)研究的研究方法、模型之間存在很大的差異，研究結(jié)果也不完全一致，關(guān)于Notch通路在T淋巴細(xì)胞分化中的作用尚有爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步的研究。

3．3 Notch受體調(diào)控調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞Tr的分化

調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞是不同于Th1和Th2的具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體，因其具有免疫抑制作用，在多種免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用，近來(lái)受到人們的廣泛關(guān)注。根據(jù)Tr表面標(biāo)記、產(chǎn)生的細(xì)胞因子和作用機(jī)制的不同，Tr可分為CD4+CD25+Tr細(xì)胞、Tr1和Th3等多種亞型。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用表現(xiàn)在激活以后抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。

研究發(fā)現(xiàn)，在CD4+CD25+Tr細(xì)胞激活后，其DLL1表達(dá)升高［18］。而且，給予CD4+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染DLL1后，明確抑制了T淋巴細(xì)胞的增殖活性和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這提示DLL1-Notch通路在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受中發(fā)揮重要作用［34］。Jagged1同樣在免疫抑制中發(fā)揮作用;轉(zhuǎn)染后過(guò)表達(dá)Jagged1的抗原呈遞細(xì)胞可促使CD4+T淋巴細(xì)胞向Tr方向進(jìn)行分化，并抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［35］。

針對(duì)小鼠心臟移植后排斥反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)表達(dá)DLL1的抗原呈遞細(xì)胞促進(jìn)了Tr的生成，抑制IFN-γ的分泌，并同時(shí)促進(jìn)了IL-10的分泌，從而明顯降低了移植物的免疫應(yīng)答反應(yīng)［36］。

4 總結(jié)和展望

從上述一系列的研究可發(fā)現(xiàn)，抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)Notch受體配體Jagged或DLL，激活CD4+T淋巴細(xì)胞的Notch信號(hào)通路，這在CD4+T淋巴細(xì)胞的分化和活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用。但是，相關(guān)研究剛剛起步，發(fā)表的成果很少，而且各個(gè)研究的模型、方法并不相同，各個(gè)研究的結(jié)果也并不完全一致。Notch通路在Th1、Th2分化及活性中的作用尚無(wú)定論。相信隨著更多研究的發(fā)表，更加標(biāo)準(zhǔn)化的研究方法和模型會(huì)逐步確立，Notch通路在周圍CD4+T淋巴細(xì)胞中的調(diào)控作用會(huì)進(jìn)一步明確。

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