轉(zhuǎn)基因常見檢測技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

方獻(xiàn)平，馬華升，余 紅，金 亮，劉 輝，張 樂，翁麗萍，來文國

(1.浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310024;2.浙江大學(xué)，浙江杭州 310058)

自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，在全球發(fā)展迅猛，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。根據(jù)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織 (ISAAA)2007年度報告，轉(zhuǎn)基因作物種植面積從1996年的170萬hm2到2007年的1.143億hm2，增長了60倍。轉(zhuǎn)基因作物種植的國家達(dá)到23個，另有29個國家同意轉(zhuǎn)基因作物作為食品和飼料進(jìn)口，或進(jìn)行環(huán)境釋放試驗。目前共有23種轉(zhuǎn)基因作物的1 247個項目獲得615項批準(zhǔn)。2006年全球轉(zhuǎn)基因作物種植者的凈收益是70億美元，1996－2006年間的累計收益達(dá)340億美元。在我國，目前批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物有抗蟲棉、延遲成熟番茄、抗病毒番茄、抗病毒甜椒和線椒、改變花色的矮牽牛以及抗病毒木瓜等，其中抗蟲棉的種植面積最大。2006年我國轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)350萬hm2，是轉(zhuǎn)基因作物種植第6大國。

然而轉(zhuǎn)基因生物在給人類帶來諸多好處的同時，其安全性問題一直備受爭議。1998年，英國Rowentt研究所的Pusztai博士在電視臺發(fā)表講話，聲稱大鼠食用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的馬鈴薯后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到破壞。此后，又相繼發(fā)生了斑碟事件、加拿大超級雜草事件、墨西哥玉米事件、中國Bt抗蟲棉事件、轉(zhuǎn)基因大豆中多余未知的DNA等一系列重大的轉(zhuǎn)基因事件，引發(fā)了國際社會對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品對人類健康和生態(tài)環(huán)境影響的激烈爭論和廣泛關(guān)注。盡管后來的調(diào)查證明，這些事件中所得結(jié)論缺乏科學(xué)依據(jù)，而且目前批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品尚未發(fā)現(xiàn)有安全性問題，但轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用畢竟只有短短的10多年，其潛在的風(fēng)險和非預(yù)期效應(yīng)難免讓人擔(dān)憂。

為了加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因作物的管理，世界各國紛紛制定了相應(yīng)的法律法規(guī)。1998年6月歐盟規(guī)定，對農(nóng)作物的種子、食品和飼料貼示標(biāo)簽，必須標(biāo)示其是否含有轉(zhuǎn)基因成分;隨后又規(guī)定，當(dāng)轉(zhuǎn)基因成分超過1%時，實行強(qiáng)制性標(biāo)識制度;2002年歐盟執(zhí)行新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理法規(guī)，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品從生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存、銷售進(jìn)行全程的跟蹤、檢測。到目前為止，已有包括歐盟國家在內(nèi)的40多個國家和地區(qū)制定了相關(guān)的法律和法規(guī)，要求對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品 (包括食品和飼料)進(jìn)行標(biāo)識管理。在我國，2001年5月國務(wù)院頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，將研究試驗、生產(chǎn)、加工、經(jīng)營和進(jìn)出口各環(huán)節(jié)都納入了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理的范疇。2002年以來，農(nóng)業(yè)部先后發(fā)布了與之配套的4個管理辦法，即《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物加工審批辦法》。這些法律、法規(guī)的實施標(biāo)志著中國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理進(jìn)入法制化、規(guī)范化的管理軌道。在我國境內(nèi)從事農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的研究、試驗、生產(chǎn)、加工、經(jīng)營和進(jìn)口、出口活動都須遵守這些條例，這是符合國際慣例，是非常必要的。在杭州市，農(nóng)業(yè)部也專門批準(zhǔn)設(shè)立了農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試杭州分中心。

轉(zhuǎn)基因生物安全問題需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全評價，而轉(zhuǎn)基因生物檢測技術(shù)是安全評價的關(guān)鍵之一。因此，研究轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測的關(guān)鍵技術(shù)，探索轉(zhuǎn)基因生物計量和全程溯源技術(shù)，建立轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)體系，成為亟待解決的關(guān)鍵問題。本文針對目前常用的轉(zhuǎn)基因安全檢測技術(shù)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物檢測中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 轉(zhuǎn)基因檢測的常用方法

目前國際社會對轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)主要有兩類，即檢測轉(zhuǎn)基因成分核酸序列和檢測轉(zhuǎn)基因成分編碼的蛋白質(zhì)。

1.1 基于核酸的檢測方法

針對外源目的DNA的檢測技術(shù)主要有3種。

1.1.1 分子雜交技術(shù)

利用 Southern Blot法，不僅能夠檢測外源DNA，而且能夠確定外源基因在植物基因組中的排列情況和拷貝數(shù)等;但Southern blot是將目的DNA進(jìn)行原位雜交，沒有擴(kuò)增、放大的過程，所以檢測的靈敏度要比PCR檢測方法低得多。

1.1.2 PCR方法

包括定性PCR方法、復(fù)合PCR方法、競爭性定量PCR方法和熒光定量PCR方法。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品PCR檢測方法的主要依據(jù)是特異性擴(kuò)增外源基因片段，對于同一待測樣品，選擇不同的特異性目的基因片段得到的PCR檢測結(jié)果可能不太一致。因此建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品PCR檢測方法時，需充分考慮特異性擴(kuò)增的目的片段。PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化、如何處理每對引物反應(yīng)效率不一致性、檢測通量不高等都是檢測中需要解決的問題。

1.1.3 基因芯片技術(shù)

該方法正處于發(fā)展階段。由于需要昂貴的檢測雜交微弱信號的裝置，需要具有對雜交信號及相關(guān)信息、數(shù)據(jù)的大規(guī)模處理和分析能力，目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測還比較少。

1.2 基于蛋白質(zhì)的檢測方法

以抗原、抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法可通過檢測外源基因表達(dá)的蛋白來定性、定量檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。建立這些檢測方法通常需要將外源結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物制備特異性的單克隆或多克隆抗體，建立Western Blot、ELISA法和試紙條法等。

Western Blot方法特異性高，可用于定性檢測，尤其適用不溶性蛋白的分析，其檢測靈敏度在種子檢測中可達(dá)0.25%，在烘烤的食品中為1%。但該方法不能進(jìn)行定量分析，操作繁瑣且費(fèi)用較高，不適合高通量檢測。

ELISA方法主要用于定性檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，借助于酶標(biāo)儀，可根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一系列濃度梯度與吸光度值制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢測樣品中目的蛋白的含量。由于缺乏轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的內(nèi)源蛋白作為對照，ELISA檢測方法不能精確定量測定轉(zhuǎn)基因含量，只能達(dá)到半定量測定的水平。

免疫試紙條檢測方法是根據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合原理建立的方法，以硝化纖維代替聚苯乙烯反應(yīng)板為固相載體，將固定有抗體的試紙條或固相帶浸入到蛋白提取液中，如果樣品中含有外源目的蛋白，試紙條上抗體可與目的蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化。該方法操作簡單、易于操作，一般5～10 min可獲得檢測結(jié)果。但一種免疫試紙條只能檢測一種目的蛋白質(zhì)，不能區(qū)分具體的轉(zhuǎn)基因品系，且檢測靈敏度較低，為0.15%。

2 轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)中的存在問題

目前常用的兩類轉(zhuǎn)基因生物檢測方法各自存在假陽性結(jié)果多、標(biāo)準(zhǔn)物研發(fā)滯后、靈敏度和準(zhǔn)確度低、操作繁瑣、效率和通量低、目標(biāo)蛋白質(zhì)和抗體制備難等問題，而大樣本量和多目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測，是分析鑒定轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品和了解轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因的功能及影響的基礎(chǔ)，是提高新品種培育效率和構(gòu)筑轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品安全性的關(guān)鍵步驟，目前國際上還沒有一種方法能很好地解決此問題。因此，有必要建立操作簡單、高效快捷和精準(zhǔn)靈敏的新的轉(zhuǎn)基因生物檢測分析方法，以適應(yīng)當(dāng)前研究和生產(chǎn)領(lǐng)域的緊迫需求。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測方法中的應(yīng)用無疑具有積極意義。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中的應(yīng)用前景

由于許多轉(zhuǎn)基因作物表現(xiàn)出一定的與外源基因相關(guān)的蛋白質(zhì)變化性狀，即多數(shù)外源基因的表達(dá)或調(diào)控產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，其表達(dá)或調(diào)控可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)種類和含量的改變。因而在蛋白質(zhì)水平上對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行檢測和研究顯得尤為重要。蛋白質(zhì)是幾乎所有生物學(xué)過程的功能單位，而蛋白質(zhì)組(Proteome)是指一個細(xì)胞在特定時間和特定環(huán)境條件下所有蛋白質(zhì)的表達(dá)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展和完善，蛋白質(zhì)組學(xué)方法在包括植物生長、病理、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等許多研究領(lǐng)域都得到廣泛應(yīng)用，并取得一系列令人矚目的研究成果。轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品主要是由水和蛋白質(zhì)組成，因此對其蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，就能提供海量的信息，展示參與決定轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品區(qū)別于非轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品之間的真正起表達(dá)作用的蛋白結(jié)構(gòu)和功能。因此，以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺和最新技術(shù)方法為依托，構(gòu)建新的基于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生物檢測評價技術(shù)體系，是解決當(dāng)前轉(zhuǎn)基因生物新品種培育和安全性評估監(jiān)測所面臨的檢測和研究技術(shù)滯后的重要手段之一。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法是一類以先進(jìn)儀器設(shè)備為支撐，對生物體蛋白質(zhì)的組成與變化進(jìn)行高通量、高靈敏度、高分辨率分析研究的新技術(shù)方法，大致可分為電泳、色譜和質(zhì)譜鑒定技術(shù)3種。

雙向電泳 (two-dimensional electrophoresis，2-DE)技術(shù)是目前使用最廣泛的一種高分辨率的分離技術(shù)。2-DE技術(shù)是利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差異，先完成第一向電泳分離，隨后利用分子量差異進(jìn)行二維電泳分離，完成蛋白質(zhì)樣品的高分辨率雙向凝膠電泳分離后，比較分析不同樣品的蛋白質(zhì)種類和含量，并將分離到的蛋白質(zhì)酶解成肽片段后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。2-DE儀器和方法較成熟，雖然操作煩瑣耗時，且消耗品較貴，但利用2-DE技術(shù)，結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，可望避免傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因生物檢測技術(shù)無法系統(tǒng)了解蛋白質(zhì)變化的缺陷，滿足精細(xì)分析生物蛋白質(zhì)組的需求，從而精確確定外源基因?qū)κ荏w生物蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，這方面已有很多報道。

多維液相色譜 (multidimensional liquid chromatography，MD-LC)技術(shù)是為適應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要新近發(fā)展起來的一類分離技術(shù)。MD-LC一般可采用毛細(xì)管色譜柱或微色譜柱，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過在線或離線的離子交換色譜、分子篩色譜、聚焦色譜、反相色譜實現(xiàn)多維分離，并在色譜分離過程中或分離結(jié)束后進(jìn)行酶切，最后直接送入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。MD-LC具有分離極端等電點(diǎn)、極端分子質(zhì)量、低豐度及疏水性膜相關(guān)蛋白的特點(diǎn)，可彌補(bǔ)2-DE不易分離這類蛋白的缺陷，在轉(zhuǎn)基因生物分析中，特別是在新基因?qū)ふ液突蚬δ荑b定中，可發(fā)揮重要作用。

質(zhì)譜 (mass spectrometry，MS)技術(shù)已廣泛用于生物分子的分析鑒定，其中串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù) (multiple reaction monitoring，MRM)具有在復(fù)雜樣品中快速定量分析多種痕量成分的特點(diǎn)，是近年來鑒定大樣本量材料中已知蛋白質(zhì)的最有效的蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)。利用質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組技術(shù)，特別是MRM-MS/MS技術(shù)，可望避免傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因生物檢測技術(shù)分析目標(biāo)蛋白質(zhì)時需先純化出蛋白質(zhì)并制備可供使用抗體的缺陷，滿足快速和自動化地直接分析轉(zhuǎn)基因生物目標(biāo)蛋白質(zhì)的需求。

在轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品安全性檢測與研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)可發(fā)揮尋找新基因、鑒定基因功能、提高分子設(shè)計和新品種培育效率、評價轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品安全性等方面的作用，具有重要意義。但無論是基于質(zhì)譜分析的非標(biāo)記定量技術(shù)，還是基于質(zhì)譜分析的穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量技術(shù)，在分析轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品時，仍需要進(jìn)行大量的研究積累，以建立適宜的分析技術(shù)體系，從而為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品研究開發(fā)和安全評估提供新的有效的技術(shù)支撐。換言之，借助先進(jìn)的基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法，構(gòu)建基于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品新檢測評價和研究技術(shù)體系，可克服現(xiàn)在常用的轉(zhuǎn)基因檢測方法的一些缺點(diǎn)，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)變化情況的深入了解，實現(xiàn)對大量樣本轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品目標(biāo)蛋白質(zhì)的精準(zhǔn)、高通量和無標(biāo)記檢測，實現(xiàn)無需抗體和純化蛋白即可直接對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中所有目標(biāo)基因表達(dá)蛋白質(zhì)的快速精確鑒定。

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