二甲雙胍調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子途徑抑制物的表達(dá)

侯英健，史小琴，韓艷梅，李 惠，郭昊天

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000)

組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，特異性抑制外源性凝血途徑，是一種控制凝血啟動的抗凝蛋白［1］。血栓形成是糖尿病的主要并發(fā)癥之一。糖尿病患者血糖持續(xù)升高，導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)的生成［2］。AGEs水平可上調(diào)組織因子，促進(jìn)血栓形成。作為控制糖尿病的一線用藥，二甲雙胍明顯緩解糖尿病并發(fā)癥［3］，但目前尚無其調(diào)節(jié)糖尿病血栓及TFPI表達(dá)的報(bào)道。本研究檢測了二甲雙胍對TFPI表達(dá)的影響，并初步探討了其中機(jī)制，為糖尿病血栓的干預(yù)提供了新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑 二甲雙胍(美國Sigma公司)，兔抗人 β-actin多克隆抗體及小鼠抗人TFPI單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 從人臍靜脈中分離原代內(nèi)皮細(xì)胞，種植于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，用含10% 胎牛血清的M199培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 糖基化牛血清白蛋白的制備 將牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖溶磷酸緩沖液中(pH 7.4)，過濾除菌后在37℃下孵育3個(gè)月。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測TFPI mRNA的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用MxPro QPCR系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR檢測。β-actin作為內(nèi)參照。

1.2.4 Western blot方法檢測蛋白表達(dá) 提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后，加入適當(dāng)濃度的第一抗體(室溫孵育4 h)和第二抗體(室溫孵育1 h)后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI mRNA水平 AGEs(50 mg·L-1)明顯下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI mRNA表達(dá)(P＜0.01)。在AGEs刺激內(nèi)皮細(xì)胞的同時(shí)，給予二甲雙胍。結(jié)果表明，1 μmol·L-1的二甲雙胍對TFPI的表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用，而5與10 μmol·L-1的二甲雙胍均明顯逆轉(zhuǎn)AGEs對TFPI的抑制作用(P＜0.05)。

2.2 二甲雙胍上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI蛋白表達(dá)水平 AGEs(50 mg·L-1)明顯下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI蛋白表達(dá)，而二甲雙胍(5 μmol·L-1)明顯逆轉(zhuǎn)AGEs對TFPI的抑制作用。

3 討論

二甲雙胍不僅能夠有效控制血糖，還明顯抑制糖尿病血管并發(fā)癥。王景尚等［4］研究表明，其機(jī)制可能為二甲雙胍降低了血漿中 AGEs的水平。但是本課題組發(fā)現(xiàn)，即使在AGEs含量不發(fā)生改變時(shí)，二甲雙胍仍能夠通過調(diào)節(jié)其下游通路發(fā)揮抗凝作用。我們以AGEs刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)給予二甲雙胍處理。檢測后發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍部分阻斷了AGEs對TFPI表達(dá)的抑制作用。本課題組之前研究表明，AMPK上調(diào)TFPI表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗血栓的作用［5］，而二甲雙胍激活A(yù)MPK的作用已得到廣泛證實(shí)。因此我們推斷AMPK信號通路參與了二甲雙胍對TFPI的上調(diào)作用。

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