乙酰肝素酶在腫瘤中的表達(dá)及其調(diào)控

李 陽(yáng)，劉 浩，蔣志文

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233000)

硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate proglycan，HSPG)是細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的重要組成部分，也可作為受體迅速結(jié)合生長(zhǎng)因子、趨化因子、酶等近百個(gè)不同的蛋白質(zhì)。他由一個(gè)核心蛋白與多個(gè)線性硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)側(cè)鏈共價(jià)連接而成，其HS側(cè)鏈帶有負(fù)電荷具有高度活性，是HSPG的活性關(guān)鍵部位。乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一能切割ECM中HS側(cè)鏈的內(nèi)切性糖苷酶，這也是Hpa影響很多生理病理過(guò)程的原因。Hpa可以影響骨、血管、毛發(fā)等形成和生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)分化、侵襲轉(zhuǎn)移也有著重要作用，在多種惡性腫瘤中Hpa的高表達(dá)高活性狀態(tài)表明其可能成為一個(gè)抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)［1－2］。本文通過(guò)對(duì)Hpa在腫瘤中的表達(dá)及調(diào)控進(jìn)行綜述，以期為以Hpa為靶點(diǎn)的腫瘤治療尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 Hpa的生物學(xué)功能

Hpa發(fā)現(xiàn)于1999年，是一個(gè)內(nèi)源性β2葡萄糖醛酸酯酶，能特異性識(shí)別并剪切HS側(cè)鏈。研究發(fā)現(xiàn)人類Hpa有兩種亞型，Hpa1與Hpa2。由于分布和功能不同，目前在腫瘤的研究中主要以Hpa1為主，它是由兩條多肽鏈以非共價(jià)鍵方式結(jié)合而成的異二聚體。在正常組織中，Hpa1 mRNA在胎盤(pán)之外的成熟非免疫組織中均不表達(dá)，但在惡性腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)。

在人類胎盤(pán)中，Hpa的兩種轉(zhuǎn)錄子都呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其在滋養(yǎng)層細(xì)胞溶解物中活性很高，這可能是Hpa促進(jìn)血管新生和滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲基底膜(basement membrane，BM)的重要因素。Hpa活性降低后，結(jié)合的各種物質(zhì)作用均受到抑制，滋養(yǎng)層細(xì)胞的分裂減速。血管生成涉及了生長(zhǎng)因子、ECM、粘附受體分子及基質(zhì)降解酶等一系列的因素，HSPG作為血管的重要組成部分［3］，這為Hpa影響血管生成、滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤(rùn)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。在增生的人類內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚和創(chuàng)面肉芽組織中發(fā)現(xiàn)，Hpa高表達(dá)刺激了角質(zhì)細(xì)胞遷移，加強(qiáng)了傷口上皮細(xì)胞和血管的成熟，明顯提高了皮瓣成活，說(shuō)明Hpa在傷口愈合處介導(dǎo)增強(qiáng)皮膚的血管生成［4］并使組織修復(fù)加速。而在腫瘤進(jìn)展的方面，Hpa對(duì)HS側(cè)鏈的切割可以破壞BM和ECM，釋放其中的生長(zhǎng)因子，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。

2 腫瘤細(xì)胞中Hpa的表達(dá)和調(diào)控

Hpa在轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)［5－6］之一，涉及到多因素多過(guò)程，除酶活性啟動(dòng)通路，AKT、Rac1、Src磷酸化及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等均參與其中。腫瘤細(xì)胞中Hpa表達(dá)與多種因素有關(guān)，包括外源環(huán)境和細(xì)胞因子等內(nèi)源因素的影響。

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控 細(xì)胞在缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、糖基化抑制、化療藥物、氧化應(yīng)激等多種因素作用下，均會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積。其中由蛋白質(zhì)堆積所引起蛋白質(zhì)合成減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解功能增強(qiáng)等后續(xù)反應(yīng)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。UPR是一種復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能夠限制非折疊蛋白的累積，最初效應(yīng)是保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，限制其他細(xì)胞器的損害，通過(guò)減少細(xì)胞的過(guò)度應(yīng)激而保護(hù)機(jī)體［7］。UPR提高細(xì)胞在有害因素下的生存能力，但未折疊的蛋白長(zhǎng)時(shí)間積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)便會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，當(dāng)UPR信號(hào)通路不能緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)便會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序［7］。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終方向是不利于細(xì)胞生存的，可在這過(guò)程中UPR的激活又使腫瘤細(xì)胞得以存活，腫瘤向更惡性的方向發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)［8］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein，GRP78)升高能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，而在本實(shí)驗(yàn)室的研究中，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞離開(kāi)原來(lái)的應(yīng)激環(huán)境，通過(guò)加速腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移使其得以生存，而這與UPR激活Hpa有著密切聯(lián)系，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

2.1.1 缺氧及pH 腫瘤缺氧時(shí)，UPR使腫瘤適應(yīng)低氧環(huán)境，ATP生成減少，而蛋白質(zhì)的折疊是ATP依賴的過(guò)程，能量不足會(huì)影響蛋白質(zhì)折疊，這些因素都使得未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。處于缺氧狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞仍能不斷增殖、浸潤(rùn)，在這個(gè)過(guò)程中低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)起著重要的作用。HIF-1是廣泛存在于腫瘤中的轉(zhuǎn)錄因子，也是腫瘤微環(huán)境缺氧的重要標(biāo)志物之一。在惡性腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，由于組織增生過(guò)快必然會(huì)造成局部組織嚴(yán)重缺氧，HIF-1蛋白水平增加，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞代謝的適應(yīng)性，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等血管生成基因的轉(zhuǎn)錄［9］，繼而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)［10］，在正常組織中Hpa僅在胚胎和淋巴結(jié)中高表達(dá)，其活性也多處于失活狀態(tài)，而在大部分易侵襲轉(zhuǎn)移的缺氧惡性腫瘤中Hpa表現(xiàn)為高表達(dá)高活性狀態(tài)，缺氧可以激活Hpa，這提示我們?nèi)毖跻蜃訁⑴c了腫瘤細(xì)胞中Hpa表達(dá)過(guò)程或參與了對(duì)其活性的調(diào)控。

Hpa僅在pH 4.0-7.5的酸性環(huán)境中發(fā)揮作用，其最佳表達(dá)活性是在pH 5.5-5.8之間，pH值越高其活性越低。腫瘤中心部位缺血缺氧都將為Hpa提供一個(gè)適宜的酸性環(huán)境，使其發(fā)揮酶的最大降解活性。如果pH大于8.0 Hpa就會(huì)失去活性，但仍擁有黏附作用。失活的Hpa和ECM中的HS結(jié)合，可作為內(nèi)切糖苷酶的儲(chǔ)庫(kù)，以便炎癥時(shí)能馬上降解ECM和BM，便于白細(xì)胞向血管外和基質(zhì)中游走。因此，局部組織的pH能夠調(diào)節(jié)Hpa的表達(dá)及活性［11］。

2.1.2 放療及藥物調(diào)控 放療對(duì)Hpa有著重要的影響，在治療胰腺癌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)劑量的電離輻射(Infrared，IR)能上調(diào)Hpa的表達(dá)，從而增加胰腺癌的轉(zhuǎn)移［12］。放療和化療藥物可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，IR單獨(dú)運(yùn)用于胰腺癌治療時(shí)，可能會(huì)通過(guò)激活UPR和Hpa而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)合了Hpa抑制劑后能夠抵消IR增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞體外侵襲的作用，減少原位胰腺腫瘤在體內(nèi)的擴(kuò)散，對(duì)防止腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是一種有效策略。

Hpa的底物HSPG具有2個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即含硫酸基團(tuán)和糖鏈，并帶負(fù)電荷，故凡具備上述特點(diǎn)的生物或化學(xué)物質(zhì)均有可能抑制Hpa活性。Hpa抑制劑分為三類，HS類似物、活性抑制劑和植物多糖。由于肝素或低分子量肝素等抗凝劑有出血等并發(fā)癥，其用于腫瘤治療受到限制。但將抗凝和抗Hpa的屬性分開(kāi)后，通過(guò)化學(xué)修飾得到了一系列的HS類似物，在高劑量時(shí)無(wú)風(fēng)險(xiǎn)，可以作為潛在的抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移藥物，如低分子量肝素、SST001和 PG545。PI-88［13］是含硫酸基的寡糖，由低聚糖磷酸鹽經(jīng)磺化作用而生成。PI-88一方面可以直接抑制Hpa的活性，同時(shí)它又通過(guò)阻抗血管生成因子及其受體與HS的相互作用，刺激凝血激酶途徑阻滯劑的釋放，從而產(chǎn)生抗血管生成的作用，達(dá)到抗腫瘤的目的。OGS 通過(guò)高通量篩選，發(fā)現(xiàn) 2，3-二氫-1，3-二氧-1H-異吲哚-5-羧酸化合物具有抑制Hpa活性的作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行衍生物合成，獲得的一系列小分子抑制劑，OGT2115作為其中最具有效果的一種，分子式為C24H16BrFN2O4，在體外實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)了很強(qiáng)的抗Hpa活性。寡聚的硫酸甘露糖醛酸(oligomannurarate sulfate，JG3)作為Hpa抑制劑的一種，在體內(nèi)外都有良好的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用［14］。它與Hpa的相互作用受到低分子量的肝素的競(jìng)爭(zhēng)，但不受其他黏多糖的影響。此外，這種化合物可以通過(guò)抑制堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子b-FGF從ECM中的釋放，抑制血管生成。

2.2 內(nèi)源因子調(diào)控

2.2.1 細(xì)胞因子和酶 Hpa可被一些蛋白酶，如胰蛋白酶和尿激酶等滅活，在炎癥發(fā)生以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，機(jī)體會(huì)大量分泌免疫因子，刺激細(xì)胞分泌Hpa，使細(xì)胞獲得在ECM中游走的能力。腫瘤壞死因子TNF-α，γ-干擾素和脂肪酸可以使內(nèi)皮細(xì)胞分泌Hpa蛋白增加，VEGF可使其分泌降低。b-FGF是一種強(qiáng)有力的血管生成因子，具有結(jié)合肝素的特性，Hpa與b-FGF在肝癌、胰腺癌、肺癌、胃癌等組織中均呈高表達(dá)且成正相關(guān)，說(shuō)明它們?cè)诖龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、血管生成中發(fā)揮重要的協(xié)同作用。而早期在黑色素瘤B16細(xì)胞和T細(xì)胞淋巴瘤的研究中［15］，Hpa促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)也密切相關(guān)。MMPs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，增強(qiáng)Hpa的表達(dá)可以導(dǎo)致MMP-9增強(qiáng)，Hpa基因沉默后導(dǎo)致 MMP-9失活。Hpa的激活同時(shí)也決定了其他MMPs的活化，尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和其受體(uPAR)也均會(huì)響應(yīng)，這些研究結(jié)果首次提供了Hpa和MMPs之間合作調(diào)節(jié)細(xì)胞表面和ECM中的HSPGs的證據(jù)。

2.2.2 上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)EMT是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力的過(guò)程，它存在于人體多個(gè)生理和病理過(guò)程中。EMT的發(fā)生涉及到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和復(fù)雜的分子機(jī)制，并與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在腎病疾病末期時(shí)，EMT參與腎間質(zhì)成纖維化并在近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌纖維母細(xì)胞中有著重要作用。FGF-2在腎小管上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)了EMT的出現(xiàn)，并與Syndecan-1相關(guān)。Syndecan-1是跨膜HSPG家族成員之一，表達(dá)于大多數(shù)上皮細(xì)胞，在不同的細(xì)胞類型和發(fā)育階段表達(dá)均有不同。Syndecan-1在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)下降，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)，可作為判斷多種腫瘤預(yù)后的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，Hpa對(duì)HS/Syndecans正確轉(zhuǎn)變是至關(guān)重要的，一個(gè)錯(cuò)誤的HS/Syndecans調(diào)控會(huì)妨礙FGF-2的活性。雖然FGF-2在野生型細(xì)胞株中誘導(dǎo)EMT，但它對(duì)Hpa沉默細(xì)胞是無(wú)效的，因此Hpa在腎小管上皮細(xì)胞中對(duì)誘導(dǎo)EMT是必要的。Hpa與EMT在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中是協(xié)同作用，F(xiàn)GF-2誘導(dǎo)的EMT通過(guò)PI3K/AKT通道，降解Syndecan-1，增加Hpa和MMP-9的表達(dá)［16］。而本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后Hpa的表達(dá)增加，且同時(shí)可誘導(dǎo)出現(xiàn)EMT，二者是否協(xié)同影響了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移仍需要進(jìn)一步研究。

2.3 基因調(diào)控

2.3.1 啟動(dòng)子甲基化和抑癌基因p53DNA甲基化是Hpa活性的重要抑制因素，DNA去甲基化可上調(diào)Hpa基因的表達(dá)。前列腺癌組織與正常組織相比，啟動(dòng)子甲基化水平較低，但Hpa的表達(dá)及活性均偏高。惡性組織中甲基化調(diào)控Hpa這一過(guò)程被干擾，Hpa啟動(dòng)子基因表達(dá)增加，造成了腫瘤轉(zhuǎn)移和血管新生。p53基因是一種轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因，分為野生型和突變型。野生型p53基因是一種抑癌基因，可限制多種應(yīng)激因素引起的過(guò)度細(xì)胞生長(zhǎng)，如DNA損傷、癌基因的活化、組織缺氧等。野生型p53被去除或活性抑制后均可導(dǎo)致Hpa表達(dá)和活性的明顯增高，這是由于野生p53結(jié)合Hpa啟動(dòng)子并抑制其活性，而p53基因突變后就不能發(fā)揮此種抑制作用［17］。

2.3.2 MicroRNA MicroRNAs(miRNAs)是一類保守的非編碼單鏈RNA，約8－25個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶基因mRNA互補(bǔ)位點(diǎn)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNAs直接作用于約30%的人類基因，而且?guī)缀鯀⑴c所有的生物過(guò)程，最近研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中miRNAs的表達(dá)失調(diào)參與了腫瘤轉(zhuǎn)移。CascioS［18］等通過(guò)模擬MCF-7乳腺癌細(xì)胞低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)miR-20b能夠通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1及STAT-3通路從而下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，起到抑癌基因的作用。而在腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，miRNAs的引入對(duì)Hpa的表達(dá)起著增加或抑制的作用。miR-1258的水平與Hpa相關(guān)表達(dá)成反比，而各種浸潤(rùn)型腫瘤的實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果，這說(shuō)明miR-1258是通過(guò)調(diào)控Hpa的表達(dá)而起作用，這為以Hpa為靶點(diǎn)治療提供了分子依據(jù)［19］。

2.3.3 其它 Ets啟動(dòng)子家族參與了Hpa mRNA在癌細(xì)胞中的表達(dá)，Ets1、Ets2有激活惡性乳腺癌細(xì)胞Hpa基因的功能，Ets成員之一GA結(jié)合蛋白需要和Sp1結(jié)合，共同調(diào)控甲狀腺腫瘤細(xì)胞Hpa轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1能影響Hpa的表達(dá)和活性，且在不同類型腫瘤中通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)控Hpa的表達(dá)。早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，早期即可對(duì)多種信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)而增加表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Hpa1的轉(zhuǎn)錄。NF-κB作為細(xì)胞內(nèi)較為下游的轉(zhuǎn)錄因子，參與了多條信號(hào)途徑，而在腫瘤細(xì)胞中也可調(diào)控Hpa1的表達(dá)。抑制NF-κB可以下調(diào)MMP-9、纖溶酶原激活物和Hpa1，從而阻止了自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌細(xì)胞中真核細(xì)胞起始因子24E(eukaryotic initiation factor24E，eIF24E)被抑制后，Hpa的活性和表達(dá)均下降，并伴有癌細(xì)胞體外侵襲力的下降，這在LS-174T細(xì)胞中已被報(bào)道［20］。

3 展望

Hpa在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段中均有表達(dá)，其促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用被闡明后，為人們治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供了新的思路。近年來(lái)以Hpa為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)也取得了一些重要的進(jìn)展，尤其是HS類似物的臨床研究［21］。此外，來(lái)自人Hpa的多肽可以引出一個(gè)對(duì)自體淋巴細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用的抗腫瘤免疫反應(yīng)，這為以Hpa為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療也奠定了基礎(chǔ)。由于Hpa在腫瘤組織中的重要性，研究Hpa在腫瘤中的表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制對(duì)腫瘤的治療尤其是在侵襲轉(zhuǎn)移方面有著重大的意義。

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