qPCR和電泳對siRNA轉染效率鑒定分析

馮軍軍

（ 山西大醫(yī)院檢驗科，山西 太原 030030）

qPCR和電泳對siRNA轉染效率鑒定分析

馮軍軍

（ 山西大醫(yī)院檢驗科，山西 太原 030030）

RNA 干擾（RNAi）技術是近些年快速發(fā)展并被越來越多人逐漸越發(fā)重視的一項基于轉錄水平上的基因阻斷技術，具有序列特異性、時效性、高效性和易操作性等諸多優(yōu)點，而研究結果證實，siRNA 即小分子干擾 RNA 是 RNAi最主要的作用因子。本文分別介紹了qPCR 和電泳兩種對 siRNA 轉染效率的鑒定方法，以供參考。

qPCR；電泳；siRNA 轉染效率；鑒定

據統計，最有效的siRNA 抑制靶基因表達效率超過90%，好的鑒定方法甚至可將表達效率提升至99%，如此對于基因治療而言，siRNA可作為基因組功能研究的有力工具，而且脂質體在所有已用于臨床試驗的基因載體中僅次于病毒載體，是最有發(fā)展前景的非病毒載體[1-3]。為此，本文分別介紹了qPCR和電泳兩種對siRNA轉染效率準確、方便、高校的鑒定方法，具體如下。

1 qPCR法

siRNA是定量檢測是RNAi抗病毒效果的關鍵，而當前RNAi作為特異抗病毒治療的熱點，因此為檢測抗CSFV特異siRNA分子，即siN1和siN2在細胞中的表達水平，必須構建篩選具有高特異性和靈敏度的siRNA特異莖環(huán)引物，而RT-qPCR及為siRNA的最優(yōu)檢測方法，其可較好地表現出特異性和靈敏度，可檢測出101-108個復制的siRNA，檢測范圍亦達到7個數量級之多，而且其平行性較好（RSQ=0.999），擴增效率也較高達到了98.3%。具體操作方法如下。

1.1 RNA提取

將抗CSFV的PK-15 細胞克隆，并培養(yǎng)在6孔細胞培養(yǎng)皿中，待其滿度達到90%-95%之間時，可將培養(yǎng)液棄掉，改用1mL PBS在冰上將細胞清洗兩次，然后根據說明書的要求加入500μL的裂解液，在提取其總的RNA，并將PK-15細胞作為陰性對照。同時，再用NanoDrop1000測量RNA的質量和濃度，并將它們裝在-80℃的環(huán)境下保存。

1.2 逆轉錄反應

逆轉錄反應包括50 mmol/L莖環(huán)引物，0.25 mmol/LdNTPs，3.33 U/μL逆轉錄酶，0.25U/μL RNA酶抑制劑，等倍的逆轉錄緩沖液，10mg總RNA，用無RNA酶水補至15μL。其反應的條件即冰上擱置5mins，15℃溫度下30mins，43℃下同樣30mins，直至85℃酶滅活5mins，最后擱置4℃將其保存。

1.3 實時定量PCR反應

該體系為10μLPCR預混液，1.5μmol/L上游引物0.7μmol/L通用下游引物，0.2μmol/L MGB探針，1.2μLcDNA 產物，去離子水補至20μL。再在實時定量PCR儀上進行反應，條件為95℃下變性15s，熱啟動10mins，再轉成60℃退火60s，收集熒光，反復循環(huán)40次。需注意的是，所有陰性細胞對照和空白對照都須充分兩遍，再去均值。

1.4 靈敏度和特異性分析

根據RT-qPCR檢測繪制標準曲線，計算細胞表達的siRNA 拷貝數，并分析此方法檢測靈敏度。在將與siRNA大小相似的內源性miRNA作為特異性分析材料，選擇PK-N1、PK-N2 和PK-siC 細胞克隆和陰性細胞PK-15和PFF的總RNA胃模板進行siRNA的RT-qPCR檢測，進而評價檢測的特異性。

2 電泳法

2.1 配置熒光染料

將SYBR Gold熒光染料用TBE緩沖液稀釋10000倍，取5μmol/ LsiRNA 溶液，吸取0；2；4；5；8；10μL分別注入聚乙烯離心管中，同時相應地加入19；18；16；15；2；10μL的緩沖液，待充分融合后制成相應的siRNA標準溶液，再在各管中加入50%蔗糖-溴酚蘭溶液5μL，待進行渦旋離心后將上述溶液分別加入20%聚丙烯酰胺凝膠5μL，然后在100V電壓下電泳2小時，待凝膠放入SYBR Gold熒光染料中染色20mins后在凝膠成像系統中觀察siRNA 條帶并拍照。

2.2 回收率實驗

回收率實驗可按照以下步驟進行，即①取空白脂質體膠體溶液10μL，并分別加入高、中、低3中不同濃度的siRNA 標準溶液各5μL靜置15mins；②加入0.1 mol/LTritonX-100溶液和0.1%肝素溶液各2μL，使siRNA 從陽離子脂質體中完全釋放；③加入RNA提取試劑即按照氯仿∶苯酚∶異戊醇=25∶24∶1比值制成的混合溶液25μL，靜置15mins后，再在4℃條件下離心20mins；④收集含有siRNA的水相部分，加入上樣緩沖液6μL，待充分混合后再取5μL混合物加入凝膠加樣孔中，根據凝膠電泳的程序觀察siRNA；⑤根據標準曲線方程算出siRNA的濃度，進而計算回收率。

2.3 精密度實驗

根據“標準曲線的繪制”項進行操作，在5日內測定高、中、低3 種濃度的siRNA含量，并計算其精密度，對此亦可以進行陽離子脂質體中siRNA 的含量測定，即精密量取載基因陽離子脂質體膠體溶液10μL，再按上述操作方法，求出siRNA的濃度值。

2.4 載基因陽離子脂質體包封率測定

siRNA會有兩部分，一部分被陽離子脂質體包裹，存在凝膠孔中，另一部分處于游離狀態(tài)，而這部分游離的siRNA經過電泳后會在凝膠中形成條帶，即致使siRNA和載基因脂質體分離。再精密量取載基因陽離子脂質體膠體溶液15μL，再加入上樣緩沖液5μL，將二者充分混合，再取混合溶液5μL加入到凝膠孔中，待電泳過程完備后，觀察游離部分的siRNA條帶情況，同時按照標準曲線計算游離siRNA濃度C1，再精密量取載基因陽離子脂質體膠體溶液10μL，根據含量測定相應方法計算陽離子脂質中的siRNA總濃度C，如此即可得到包封率（被包裹物質（如某藥物）在脂質體懸液中占藥物總量的百分量）=（C-C1）/C × 100%。

3 兩種方法對siRNA轉染效率的鑒定結果

3.1 電泳法鑒定結果

通 過 對 脂 質 中 siRNA含 量 的 測 量 ， 檢 測 其 線 性 范 圍 為0.2～2.0μmol/L，其中R=0.9931，另高中低三種溶液濃度分別為96.36%，96.93%和100.75%，其中n=3，另5日內和日間的精密度RSD均＜5%，符合方法學要求。

3.2 qPCR法鑒定結果

通過qPCR法對siRNA轉染效率的鑒定結果表明，高、中、低3 種濃度的回收率在95.1%～101.2%之間，且RSD的精密度均＜2.0%，符合方法學要求。

4 討 論

4.1 電泳法

計算機技術的快速發(fā)展和應用使得對電泳圖譜的分析更加科學化和精確化，比如ImageJ即是一種可對圖像面積、重心、平均密度以及多邊形區(qū)域進行分析的圖像分析程序，它可以自動對圖像進行點的分析、以及測定路徑長度和角度等諸多功能。實踐證明，采用ImageJ分析電泳圖譜靈敏度較高、重復效果好，劑量-密度/亮度的線性關系明顯，而且操作簡單、取樣量少、分析快速精確等諸多優(yōu)點，因此可有效提高工作人員的工作效率。

4.2 qPCR法

本文所闡述的RT-qPCR法，可較準確的定量檢測細胞抗病毒siRNA 的表達水平，例如在抗豬瘟病毒轉基因動物的構建中，它可有效提高你抗病毒轉基因動物的成功率，并未將來轉基因動物的抗病毒效果評價提供有力參考，不僅如此，此法對siRNA 、miRNA等小RNA的檢測工作亦具有很好的參考價值。

5 總 結

電泳法和qPCR法均可準確、可靠、穩(wěn)定地對siRNA轉染效率進行鑒定，且其穩(wěn)定性高，操作方便簡單，可有效用于陽離子脂質體中siRNA的含量檢測。值得注意的是，在電泳法中，要想讓siRNA 從陽離子材料中釋放，必須加入去縮合劑。在實際應用中，工作人員需結合具體實際選擇性操作。

[1]柴翠翠,單麗輝,齊蕾,等.siRNA反向轉染法提高原代癌相關纖維母細胞轉染效率的研究[J].山東醫(yī)藥,2012,52(24):34-36.

[2]劉帥,李江南,袁婷,等.莖環(huán)法RT-qPCR定量檢測細胞抗豬瘟病毒siRNA的表達[J].動物及獸醫(yī)生物技術,2012,28(1):26-36.

[3]沈雁,涂家生,龐卉,等.凝膠電泳法及熒光光度法測定siRNA陽離子脂質體的含量和包封率[J].藥學學報,2009,44(4):430-435.

R446.6

：A

：1671-8194（2013）03-0398-02