去甲斑蝥素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制及臨床應(yīng)用前景的研究*

常 城 何仁勝 劉少平

（湖北省黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

斑蝥是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，有效成分—斑蝥素（CA）對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。臨床主要用于治療肺癌、食管癌及胃癌等，并有獨(dú)特的升高白細(xì)胞作用。但因其具有強(qiáng)烈的泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)刺激作用，不易為患者接受。近年來(lái)研究表明，去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)體外培養(yǎng)的多種消化道腫瘤細(xì)胞均有明顯的殺傷作用，具有良好的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期，抑制DNA的合成代謝，影響細(xì)胞的有絲分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。除此以外，NCTD 還具有抗腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。本文現(xiàn)將近年來(lái)NCTD 抗腫瘤的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用前景研究概述如下。

1 構(gòu)效關(guān)系

NCTD 是由呋喃及順丁烯二酸酐通過(guò)Diels-Alder反應(yīng)合成制得，與CA 構(gòu)型相同，唯1，2 位無(wú)甲基。去除斑蝥素的兩個(gè)甲基后，泌尿系刺激基本消失，升白效果更明顯，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)中兩個(gè)甲基是泌尿系刺激的主要功能團(tuán)，對(duì)抗腫瘤及升白的影響則小。有實(shí)驗(yàn)表明CA 和NCTD 在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面有相似的特性。

2 NCTD 抗消化道腫瘤的作用機(jī)制研究

2.1 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 腫瘤是細(xì)胞增生失控引起的。正常細(xì)胞增殖與凋亡處于一個(gè)平衡狀態(tài)，若細(xì)胞增殖超過(guò)凋亡，則表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要基礎(chǔ)。李功權(quán)等［1］采用Annexin V 和PI 雙染和流式細(xì)胞儀法進(jìn)行凋亡檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用NCTD 10 μg/mL 處理肝癌細(xì)胞12 h后收集細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)。結(jié)果顯示NCTD 處理可使27%的SMMC-7721的細(xì)胞發(fā)生凋亡，明顯高于對(duì)照組（NCTD 10 μg/mL）的凋亡率7%。NCTD 處理可使30%的BEL-7402的細(xì)胞發(fā)生凋亡，也明顯高于對(duì)照組的凋亡率8%，表明NCTD 對(duì)此兩株肝癌細(xì)胞均有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用。

2.2 阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期 研究表明，惡性腫瘤的無(wú)限制增殖與細(xì)胞增殖周期的失控有關(guān)，細(xì)胞周期的失控與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，NCTD 可作用于細(xì)胞周期的不同時(shí)期，使細(xì)胞周期阻滯、分裂受阻從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前公認(rèn)的細(xì)胞周期調(diào)控模式是細(xì)胞周期在多個(gè)調(diào)控點(diǎn)上受到調(diào)節(jié)。其中有3個(gè)調(diào)控點(diǎn)最為重要，G1/S 期，G2/M 期和有絲分裂中期、后期的交界處。在這些調(diào)控點(diǎn)上的失控就很容易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。到目前為止，已有3 類細(xì)胞周期調(diào)控因子被發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞周期素（cyclin）、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK）和細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制物（CDKI）。Fan 等［2］將GBC-SD 細(xì)胞分為NCTD 組合對(duì)照組。MTT 法測(cè)定細(xì)胞抑制率、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCTD 能抑制細(xì)胞的增值，48 h半數(shù)致死量為56.18 μg/mL。NCTD 作用功細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀觀察發(fā)現(xiàn)：G2/M 期細(xì)胞明顯增多，而S期細(xì)胞明顯減少。為進(jìn)一步了解NCTD 阻滯GBC-SD細(xì)胞周期的機(jī)制，作者用RT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、p27、Cip/Kip的表達(dá)，結(jié)果提示cyclin D1、p27 mRNA 表達(dá)降低，而Cip/Kip 表達(dá)增高。結(jié)果表明，NCTD 可能是通過(guò)降低增殖相關(guān)基因cyclin D1、p27 表達(dá)和上調(diào)抑癌基因Cip/Kip的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

2.3 抑制細(xì)胞DNA 及蛋白質(zhì)的合成 DNA 復(fù)制起始蛋白是真核細(xì)胞起始DNA 復(fù)制所必須的調(diào)控因子，包括Cdc6、Orc、Cdtl 和Mcm2-7，其中Cdc6 蛋白具有癌基因功能，可促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，通過(guò)抑制Cdc6 可產(chǎn)生抗腫瘤作用，Cdc6 已被證實(shí)可作為有效的抗腫瘤靶點(diǎn)。李金龍等［3］用BrdU 滲入法檢測(cè)NCTD 對(duì)HeLa細(xì)胞DNA 復(fù)制的變化。結(jié)果顯示：作用細(xì)胞12 h 后，BrdU 滲入受到明顯抑制，表明NCTD 可抑制HeLa 細(xì)胞DNA 復(fù)制。同一實(shí)驗(yàn)還觀察到NCTD 作用細(xì)胞24 h后，DNA 復(fù)制起始Cdc6 被降解成較小的片段。

2.4 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 近年來(lái)，人們對(duì)凋亡的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，并已取得一些可喜成果?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些對(duì)細(xì)胞凋亡起重要調(diào)控作用的蛋白，如Bc1-2/Bax、Caspase、Cyto C 等，這些蛋白的表達(dá)異常會(huì)促使細(xì)胞惡性增殖并阻止細(xì)胞凋亡。Bcl-2 為凋亡抑制蛋白，而B(niǎo)ax 功能與之相反，可加速細(xì)胞凋亡的進(jìn)展。Bcl-2 通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax 形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bcl-2 形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)了Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡的功能。

Li 等［4］認(rèn)為NCTD 誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的凋亡與線粒體通路有關(guān)。他們選用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，MTT 檢測(cè)細(xì)胞抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞 凋 亡，Westren-Blot 檢 測(cè)Cyto C、Caspase C、Bax/Bcl-2、AIF 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示NCTD 能夠抑制SMMC-7721 細(xì)胞的表達(dá)且成時(shí)間-劑量依賴性。NCTD作用細(xì)胞24 h 后，抑制凋亡的Bcl-2 蛋白表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增加，Cyto C、Caspase 3 表達(dá)增加。該結(jié)果提示NCTD 可能是通過(guò)誘導(dǎo)Bax 表達(dá)增加，使線粒體通透孔道（PT）開(kāi)放，線粒體內(nèi)的蛋白Cyto C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與細(xì)胞質(zhì)中的Apaf-1 及Caspase-9 前體形成凋亡小體活化Caspase-9，進(jìn)一步活化Caspase 3 啟動(dòng)Caspase 級(jí)聯(lián)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響 臨床研究表明，許多癌癥患者最終死于腫瘤的全身轉(zhuǎn)移而不是原發(fā)病灶，究其原因主要是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)侵襲性，能突破正常細(xì)胞基底膜轉(zhuǎn)移到其他部位形成轉(zhuǎn)移灶。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻止腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移便成為抗癌治療的基本原則。趨化因子能募集特定的細(xì)胞到特定的區(qū)域，如果腫瘤細(xì)胞的趨化因子持續(xù)高表達(dá)，就有可能增加癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的概率，研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4/CXCL12生物學(xué)軸與腫瘤的發(fā)生密切。當(dāng)CXCL12與CXCR4特異性結(jié)合后，便趨化相應(yīng)細(xì)胞到達(dá)相應(yīng)部位，從而發(fā)揮刺激腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移、新生血管生成、抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫效應(yīng)等作用，最終形成轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤。徐小峰等［5］通過(guò)real time PCR 和Western Blot 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的NCTD 對(duì)體外培養(yǎng)的MCF-7 細(xì)胞均具有抑制其CXCR4 mRNA 和蛋白表達(dá)的作用，且呈濃度依賴性。表明NCTD 具有抑制乳腺癌細(xì)胞遷移的作用，從而為NCTD的抗腫瘤臨床應(yīng)用進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

3 臨床應(yīng)用

3.1 抑制腫瘤 近年來(lái)NCTD 在消化道腫瘤中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，主要原因是其能較好地抑制腫瘤生長(zhǎng)，改善癥狀，延長(zhǎng)生存期，提高機(jī)體免疫功能，并且具有較小的毒副作用。因此在臨床上的應(yīng)用也受到越來(lái)越多的關(guān)注。臨床實(shí)踐表明，使用NCTD 治療原發(fā)性肝癌可使患者食欲增加，腹脹、肝區(qū)疼痛減輕或消失，生存期明顯延長(zhǎng)。簡(jiǎn)光富等［6］采用NCTD 注射液肝內(nèi)瘤體中心注射治療原發(fā)性肝癌20例，完全緩解率10%（2例），中數(shù)緩解期1年6個(gè)月；部分緩解率60%（12例），中數(shù)緩解期10個(gè)月；穩(wěn)定率20%（4例），中數(shù)緩解期9個(gè)月；進(jìn)展10%（2例）。表明NCTD 治療肝癌具有癥狀消失快、體重增加、中數(shù)治療后生存期也明顯延長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

3.2 升高白細(xì)胞 臨床研究發(fā)現(xiàn)NCTD 亦具有升高白細(xì)胞的作用，是目前唯一具有此作用的抗腫瘤藥物。鄭英蘭等［7］取介入治療的原發(fā)性肝癌患者80例，介入治療4個(gè)月中聯(lián)合給予NCTD，觀察介入聯(lián)合NCTD的療效。發(fā)現(xiàn)治療后實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，而且實(shí)驗(yàn)組的白細(xì)胞總數(shù)有逐漸增多的趨勢(shì)，說(shuō)明NCTD 有獨(dú)特的升高白細(xì)胞作用。這種作用原理，早期可能是加速骨髓成熟或釋放所致，后期則可能是與促造血干細(xì)胞的增殖并向粒-單系祖細(xì)胞不斷分化有關(guān)。

3.3 抗纖維化 纖維化可發(fā)生于多種器官，主要病理改變?yōu)槠鞴俳M織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)進(jìn)展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。目前纖維化類疾病在臨床上缺乏有效的治療方法，尋找新的抗纖維化藥物顯得尤為迫切。Li 等［8］將腎小管模型SD 大鼠分為對(duì)照組、NCTD 低劑量組（每日0.05 mg/kg）、NCTD 高劑量組（每日1 mg/kg）。NCTD 每日給藥1次，分別于給藥后的第1 周和第8 周處死小鼠，免疫組化測(cè)FN、膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1 和磷酸酶的表達(dá)。結(jié)果高低濃度NCTD 均能降低FN、膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1 和磷酸酶的表達(dá)，表明去甲斑蝥素能抑制腎小管纖維化。

3.4 抗病毒 斑蝥素具有較強(qiáng)的抗RNA、DNA 病毒作用，內(nèi)服治療乙型肝炎，外涂治療尖銳濕疣，均取得較好療效。研究表明斑蝥制劑有良好的抗病毒作用，甲基斑蝥素對(duì)2.2.15 細(xì)胞株分泌的HBsAg 和HBeAg 具有抑制作用，并有一定抗HBV 病毒作用，為臨床應(yīng)用甲基斑蝥胺抗乙型肝炎抗病毒治療提供理論依據(jù)［9-10］。斑蝥膏外涂治療尖銳濕疣，由于乳膏吸收后殺死疣體中病毒，而使疣體變色、萎縮、脫落，取得非常理想的效果［11］。

4 展 望

從中藥中分離有效的抗癌活性成分是尋找新抗癌藥物的有效途徑之一。具有療效顯著、毒性小等特點(diǎn)的NCTD 已被證實(shí)具有較為肯定的抗腫瘤作用。但迄今為止，對(duì)其抗腫瘤作用具體的分子機(jī)制仍不完全明確，同時(shí)還缺乏臨床前多種動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)資料，包括器官特異性、劑量效應(yīng)關(guān)系等，因此NCTD 要真正進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)以及最終成為抗腫瘤藥物仍需要進(jìn)行更深入的研究。我國(guó)的斑蝥資源十分豐富，使斑蝥成為具有重大研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥用資源，我們應(yīng)更深入地研究斑蝥的藥理作用，這從而發(fā)揮出巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

［1］李功權(quán)，張水軍，呂建鋒，等.去甲斑蝥素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90（30）：2145-2148.

［2］Fan YZ，F(xiàn)u JY，Zhao ZM，et al.Effect of norcantharidin on proliferation and invasion of human gallbladder carcinoma GBC-SD cells［J］.World J Gastroenterol，2005，11（16）：2431-2437.

［3］李金龍，蔡于琛，胡志明，等.去甲斑蝥素對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制起始蛋白Cdc6的抑制作用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（8）：1851-1853.

［4］Li JL，Cai YC，Liu XH.Norcantharidin inhibits DNA replication and induces apoptosis with the cleavage of initiation protein Cdc6 in HL-60 cells［J］.Anticancer Drugs，2006，17（3）：307-314.

［5］徐小峰，陳文萍，徐玲，等.去甲斑蝥素對(duì)CXCR4表達(dá)及MCF-7 細(xì)胞遷移的影響［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2010，31（2）：122-125.

［6］簡(jiǎn)先富，林金梅，梁寶英，等.去甲斑蝥素肝內(nèi)注射治療原發(fā)性肝癌20例臨床觀察［J］.福建醫(yī)藥雜志，1990，12（6）：48-49.

［7］鄭英蘭，史春雷，賀延新.去甲斑蝥素治療肝癌的臨床研究［J］.河北醫(yī)學(xué)，2005，11（9）：820-821.

［8］Li Y，Chen Q，Liu FY.Norcantharidin attenuates tubulointerstitial fibrosis in rat models with diabetic nephropathy［J］.Ren Fail，2011，33（2）：233-41.

［9］陸德云，王甦，趙連三.影響拉米夫定相關(guān)乙肝病毒YMDD變異的因素［J］.世界華人消化雜志，2005，13：2243-2245.

［10］Romero MR，Serrano MA，Efferth T，et al.Effect of cantharidin，cephalotaxine and homoharringtonine on ＂in vitro＂models of hepatitis B virus（HBV）and bovine viral diarrhoea virus（BVDV）replication［J］.Planta Med，2007，73：552-558.

［11］陳佐龍，畢煥州，劉瑛琦.斑蝥素乳膏外用治療尖銳濕疣50例［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002，30（4）：28-28.