脾切除對肝硬化后肝癌患者機體炎癥免疫反應(yīng)影響研究

謝志明

1 研究意義

原發(fā)性肝癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，肝硬化是HCC發(fā)生的主要危險因素之一。目前對脾臟與HCC關(guān)系的研究重點大多集中在脾臟在HCC的進展和治療過程中的作用，而對脾臟在肝硬化后肝癌患者機體作用影響研究報道很少。本組對肝硬化后肝癌患者手術(shù)聯(lián)合切脾與不切脾患者外周血 CD4，CD8 和 CD4/CD8 以及 IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10等水平表達差異進行研究，以期從炎癥、免疫的角度探討脾切除對肝硬化后肝癌患者預(yù)后影響。

2 研究現(xiàn)狀及分析

大量研究表明，肝炎后肝硬化是HCC發(fā)生的主要危險因素之一。正常脾臟是人體重要的免疫器官，而在肝硬化后門脈高壓癥形成后，出現(xiàn)充血性脾腫大，可見脾竇擴張，脾內(nèi)纖維組織增生，單核-吞噬細胞增生和吞噬紅細胞現(xiàn)象，臨床除有脾腫大外，還有外周血細胞減少，稱為脾功能亢進，是肝硬化患者常見臨床綜合征。此外，脾臟與肝癌的關(guān)系十分密切，75% ～90%的肝癌患者合并不同程度的肝硬化，其中11%～33%合并脾功能亢進，脾臟又可通過不同水平的免疫調(diào)控作用，對腫瘤發(fā)生和發(fā)展有抑制作用。腫瘤免疫以T細胞免疫為核心［1］。CD4細胞主要分泌細胞因子以調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫，CD8細胞主要分泌抑制性T細胞因子發(fā)揮特異性免疫抑制作用。因此，測定CD4，CD8和CD4/CD8可在一定程度上反映機體免疫功能。

3 研究內(nèi)容指標(biāo)

3.1 研究對象 選擇2013年1月至2015年1月我院收入的肝硬化后肝癌患者60例，所有肝癌患者均接受快速活檢針行肝穿刺活檢確診?；颊咝蠦超或CT顯示有肝硬化。入選患者根據(jù)治療方式的不同分為兩組，肝癌切除聯(lián)合脾切除組及單純肝癌切除組，每組30例。另取30例健康無肝臟相關(guān)疾病患者作為正常對照組。

3.2 手術(shù)指征 入選肝癌患者均行肝切除手術(shù)，患者肝切除手術(shù)指征中:肝功能正?；蛘邇H有輕度的肝功能損害，肝功能分級為Child A級和Child B級。肝癌腫瘤單發(fā)或者多發(fā)，其中多發(fā)單純局限于相鄰的2～3個肝段之內(nèi)。影像學(xué)顯示腫瘤側(cè)的肝組織無明顯的代償性增大，且無腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。

3.3 評價指標(biāo) ①對比兩組患者手術(shù)時間、術(shù)中平均失血量、術(shù)后住院時間、并發(fā)癥發(fā)生情況、術(shù)后2年內(nèi)死亡率及復(fù)發(fā)率。②兩組患者肝功能、白細胞、血小板和總膽紅素對比。③兩組炎癥因子對比:患者術(shù)后1周檢測炎癥因子情況，全部入選者均于空腹采血，并進行血清分離，保存于-70℃待用。細胞因子采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定，將抗人IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10 的單抗包被于酶標(biāo)板上，然后再用樣品和標(biāo)準(zhǔn)品與單抗結(jié)合，隨后加入生物素化的抗人IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10，形成免疫復(fù)合物連接在板上，然后辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，然后加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，并在45Onm處測0D值。先通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，后求出標(biāo)本中的 IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10濃度。為了保證數(shù)值的準(zhǔn)確性及減少誤差，待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)孔均做復(fù)孔，每次測定同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。④兩組術(shù)后免疫功能情況對比:患者術(shù)后1周檢測免疫功能情況，檢測T細胞亞群CD4，CD8和 CD4/CD8。CD4，CD8，CD4/CD8采用流式細胞儀檢測(FCM)。

3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用±s做統(tǒng)計描述，資料對比采用χ2檢驗，其中P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 擬解決的關(guān)鍵問題

①選擇肝硬化后肝癌患者，制定肝硬化、肝癌患者的納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)。②掌握炎癥因子的ELISA檢測方法。③掌握流式細胞儀檢測方法。

5 可行性分析

①肝硬化及肝癌患者在我國發(fā)病率較高，標(biāo)本容易采集。②本研究所有樣本均來自于我院，標(biāo)本方便收集。③實驗所涉及技術(shù)方法均以掌握，實驗所需試劑均能獲得。

6 本項目的特色與創(chuàng)新之處

目前，在國內(nèi)外從炎癥、免疫角度探討脾切除對肝硬化后肝癌患者預(yù)后影響的研究并不多見，本研究通過探討脾切除后炎癥因子及免疫功能改變的情況，從而了解脾切除對肝硬化后肝癌患者預(yù)后影響。相關(guān)研究預(yù)期2015年底結(jié)題并進行資料總結(jié)。

［1］陳中，倪家連，劉魯岳，等.CD4～+CD25～ +調(diào)節(jié)性T細胞在肝癌微環(huán)境中的分布狀況與局部免疫狀態(tài)的關(guān)系.中國普通外科雜志，2007，16(7):571-575.