黑安格斯牛超數(shù)排卵試驗(yàn)效果分析

馮亞杰，吳 姣，王二耀，施巧婷，辛?xí)粤?，魏成斌，楚秋霞，王治方，徐照學(xué)

黑安格斯牛源于英國(guó)的安格斯郡，以此得名。該牛體軀寬深，呈圓筒形，四肢短而直，前后擋較寬，全身肌肉豐滿，出肉率高，肉質(zhì)好，肌肉大理石紋明顯并具有耐粗飼，飼料報(bào)酬高等優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)許多地區(qū)于上世紀(jì)80年代就開始引進(jìn)安格斯肉牛用于本地牛的雜交改良，經(jīng)多年研究表明其雜種后代具有極強(qiáng)的適應(yīng)性和良好的發(fā)育性能。近年來隨著我國(guó)對(duì)優(yōu)質(zhì)牛肉需求量的增多，安格斯肉牛將成為極具商品價(jià)值的優(yōu)良品種。筆者于2011年4月份至5月份選擇黑安格斯母牛做為供體牛進(jìn)行了超數(shù)排卵及胚胎移植的試驗(yàn)，目的是為利用胚胎移植加速該品種快速擴(kuò)繁的相關(guān)研究和應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體牛和受體牛的選擇及飼養(yǎng)管理 挑選卵巢機(jī)能正常且無生殖道疾病的黑安格斯母牛為供體牛，年齡在3～4歲，營(yíng)養(yǎng)中上等。挑選供體的同時(shí)注射維生素ADE 10mL，以后在原有的飼養(yǎng)基礎(chǔ)上，每天增喂精料1kg，自由采食及飲水。

在同一養(yǎng)殖場(chǎng)挑選卵巢機(jī)能正常且無生殖道疾病的西雜牛為受體牛，年齡在2～3歲左右，營(yíng)養(yǎng)中等。在原有的飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每天增喂精料1kg，自由采食及飲水。

1.1.2 藥品和器材 進(jìn)口FSH（加拿大，規(guī)格400 mg／瓶）；前列腺素D－PG（上海計(jì)劃生育研究所生產(chǎn)，規(guī)格0.15mg／支）；陰道埋植栓（CIDR，新西蘭生產(chǎn)）；促性腺激素釋放激素（GnRH，上海計(jì)劃生育科學(xué)研究所生產(chǎn)，規(guī)格200mg／支）；維生素ADE注射液；杜氏磷酸鹽緩沖液（D－PBS，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司）；體視顯微鏡（尼康SMZ645）；胚胎采集及移植器械（購(gòu)自日本富士平工業(yè)株式會(huì)社）。

1.2 方法

1.2.1 供體牛超排處理方法與程序 供體牛超排處理采用CIDR＋GnRH＋FSH＋PG方法。于供體牛陰道內(nèi)放置CIDR（記為第0d），第7d肌注Gn－RH 100mg，第10d開始遞減法注射FSH，每隔12 h注射一次，連續(xù)注射8次，總劑量為340mg。在第1次注射FSH的同時(shí)注射維生素ADE 10mL，在第6次和第7次注射FSH的同時(shí)注射前列腺素D－PG 0.15mg，第7次注射FSH的同時(shí)去掉CIDR，撤栓后24h開始觀察發(fā)情，每隔6h觀察一次，記錄發(fā)情準(zhǔn)確時(shí)間。母牛發(fā)情后第12h開始輸精，第一次輸精后12h再次輸精一次，每次輸2支進(jìn)口安格斯細(xì)管凍精。輸精后間隔7d開始非手術(shù)法沖胚。

1.2.2 受體牛同期發(fā)情 受體牛同期發(fā)情處理采用CIDR＋PG方法。在供體牛放置CIDR的當(dāng)天，受體牛陰道內(nèi)放置CIDR，放栓當(dāng)天定為0d，放栓后的第13d，肌肉注射前列腺素 D－PG 0.15mg，觀察發(fā)情，記錄時(shí)間。

1.2.3 胚胎移植 在實(shí)體顯微鏡下?lián)斐雠咛?，根?jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)［1］將胚胎分為 A，B，C，D級(jí)，其中 A，B，C級(jí)胚胎可用于胚胎移植。移植方法如下：保持無菌狀態(tài)下將裝有胚胎的細(xì)管裝入移植槍，套上硬外套、軟外套，移植前，在受體牛薦尾結(jié)合部硬鞘膜外腔內(nèi)注射5%的普魯卡因5mL麻醉，高錳酸鉀清洗外陰，用無菌紙擦拭干凈，直腸把握法將胚胎輸入具有A等級(jí)或B等級(jí)的黃體一側(cè)的子宮角小彎處。

2 結(jié)果

2.1 超排效果

本次共選擇9頭青年純種黑安格斯牛進(jìn)行超排，共沖出胚胎84枚，其中可用胚胎69枚。其中A級(jí)胚胎48枚，B級(jí)胚胎14枚，C級(jí)胚胎7枚，不可用胚胎15枚。收集胚胎為9.3枚／頭，平均每頭獲得可用胚胎數(shù)為7.6枚／頭。

2.2 受體同期發(fā)情效果及胚胎移植妊娠率

本次共選擇85頭西雜母牛進(jìn)行同期發(fā)情處理，發(fā)情72頭，同期發(fā)情率為84.7%。受體經(jīng)黃體檢查評(píng)定后可用56頭，受體利用率為77.7%。實(shí)際鮮胚移植56頭受體牛。3個(gè)月妊娠檢查有31頭懷孕。妊娠率為55.4%。

3 討論

3.1 影響超排的因素

牛的超數(shù)排卵是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，同時(shí)受到季節(jié)、年齡、胎次、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀況和激素等諸多因素影響［2－7］。季節(jié)選擇在春季和秋季效果較好，有結(jié)果表明，頭均可用胚胎數(shù)量3月份最高，8月份最低，兩者間差異顯著［8］。因此選擇在氣候適宜牛生理狀態(tài)的季節(jié)進(jìn)行超排效果較為理想。不同年齡段以3～6歲的供體超排效果較好，經(jīng)產(chǎn)牛的效果好于青年牛［9］。舒適的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)狀況良好的供體也是影響超排效果的重要因素，減少對(duì)供體的應(yīng)激并保持正常能量攝入可以提高可胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。有研究表明［10］：適當(dāng)補(bǔ)加飼料，超排效果會(huì)顯著提高，而且胚胎發(fā)育良好，A、B級(jí)胚胎比例高。這些文獻(xiàn)報(bào)道說明在超排試驗(yàn)中的前期準(zhǔn)備工作是不可忽視的，因此盡量減少各種不利因素的影響是取得滿意的效果的保證。

在激素使用方面，目前報(bào)道對(duì)牛超排使用過的促性腺激素有三類：FSH（卵泡刺激素）、PMSG（孕馬血清促性腺激素）、hMG（人絕經(jīng)后促性腺激素）。而在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中很少使用PMSG和hMG，因?yàn)镻MSG在牛體內(nèi)的半衰期太長(zhǎng)，從而引起對(duì)卵巢的持續(xù)刺激，會(huì)出現(xiàn)不排卵和胚胎質(zhì)量降低等現(xiàn)象［11］。而hMG的價(jià)格較貴且有文獻(xiàn)報(bào)道其超排效果與FSH基本一致［12］。因此FSH仍是目前最常用的激素。對(duì)于FSH的選擇上，激素質(zhì)量穩(wěn)定性是影響超排效果的關(guān)鍵，是直接決定胚胎數(shù)量與質(zhì)量的重要因素。王軍［13］選用國(guó)產(chǎn)FSH和進(jìn)口FSH對(duì)西門塔爾牛進(jìn)行超排的試驗(yàn)結(jié)果表明，進(jìn)口FSH所獲得的胚胎數(shù)及可用胚胎數(shù)均明顯高于國(guó)產(chǎn)FSH。馮建忠［14］、李銘［15］、秦殿武［16］等亦有類似結(jié)論的報(bào)道。因此本次試驗(yàn)也采用加拿大FSH對(duì)安格斯母牛超排，在340mg的劑量下，收集胚胎為9.3枚／頭，平均每頭獲得可用胚胎數(shù)為7.6枚／頭。超過國(guó)際胚胎協(xié)會(huì)報(bào)道的平均水平［17］。

3.2 GnRH和維生素ADE對(duì)胚胎質(zhì)量的影響

GnRH及其類似物是一種調(diào)節(jié)生殖的神經(jīng)激素，能夠促進(jìn)垂體釋放促性腺激素，通過影響LH釋放，促使LH的分泌。所以在超排過程中通過配合GnRH，可以提高超排牛血液中LH水平，與外源性FSH共同作用，使多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，并間接促進(jìn)卵泡破裂排卵，改善超排效果。另外GnRH可能還具有改善超排牛輸卵管及子宮環(huán)境的作用，有利于胚胎的正常發(fā)育，提高胚胎可用率［18］。在本研究中，獲得的正常胚胎率為82%，與喬海生［19］報(bào)道的相一致，證明GnRH和FSH配合使用提高可用胚胎率的效果是可靠的。維生素ADE屬于牛體內(nèi)不能合成的外源性維生素，維生素A可以維系上皮組織的完整性，當(dāng)維生素A缺乏時(shí)，引起卵泡上皮細(xì)胞變性而形成卵泡閉鎖或囊腫。維生素D對(duì)鈣鹽和磷鹽的代謝有密切關(guān)系，鈣磷缺乏時(shí)，可以影響卵巢的機(jī)能，阻礙卵泡的發(fā)育。維生素E可促進(jìn)性激素的分泌，調(diào)節(jié)卵巢的發(fā)育。本研究中在超數(shù)排卵時(shí)注射維生素ADE后，A級(jí)胚胎獲得比率為69.6%，這與曾滔［20］報(bào)道使用維生素ADE獲得的A級(jí)胚胎明顯高于未使用的對(duì)照組所得結(jié)論基本一致。說明在供體超排處理時(shí)適當(dāng)注射維生素ADE，對(duì)于提高胚胎的質(zhì)量還是有利的。

3.3 受體的同期發(fā)情和胚胎移植妊娠率

目前同期發(fā)情處理方法有一次PG法、二次PG法、CIDR＋PG法。有文獻(xiàn)報(bào)道［21］，經(jīng)CIDR處理高于一次PG處理的受體利用率，兩者差異極顯著。其原因是放置CIDR使母牛維持較高濃度的孕酮水平，由于有高水平孕酮的存在，可使氯前列烯醇溶解黃體很徹底，使發(fā)情集中，黃體同期化程度高。而單純注射氯前列烯醇作用較單一，發(fā)情較分散、黃體同期化程度較低，影響了移植妊娠率。雖然二次PG法比一次PG法的同期性更好，但操作周期太長(zhǎng)，如果高百分比的母畜未處在發(fā)情周期，可導(dǎo)致很低的受孕率。因此，CIDR＋PG這種方法是目前最常用的處理方法而且移植利用率較高。

對(duì)于移植受體來說，除了考慮生殖系統(tǒng)方面的因素，受體的營(yíng)養(yǎng)狀況越來越引起人們的重視。如果受體牛缺乏營(yíng)養(yǎng)，卵巢會(huì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，形成黃體的質(zhì)量較差，不利于胚胎的著床［22］。周順成等［23］報(bào)道營(yíng)養(yǎng)是影響家畜黃體形成的主要因素，何光中［24］等對(duì)比對(duì)營(yíng)養(yǎng)不足的黃牛進(jìn)行補(bǔ)飼和不補(bǔ)飼，結(jié)果表明補(bǔ)飼組黃牛發(fā)情率和移植妊娠率明顯大于不補(bǔ)飼組。因此，挑選營(yíng)養(yǎng)狀況良好的受體，以及在胚胎移植前后的飼養(yǎng)管理是影響妊娠率的關(guān)鍵，特別是移植后的胚胎著床和發(fā)育階段。另外，季節(jié)也是影響胚胎移植妊娠率的一個(gè)因素，要避開過熱和過冷溫度對(duì)牛造成的應(yīng)激，胚胎移植就會(huì)得到一個(gè)較高的受胎率，因此春季和秋季是進(jìn)行胚胎移植的最佳季節(jié)，此時(shí)會(huì)得到較高的受胎率［25］。

［1］Overstrom E W.In vitro assessment of embryo viability［J］.Theriogenology，1996，（45）：3－16.

［2］王建辰，章孝榮.動(dòng)物生殖調(diào)控［M］.安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1998，231－280.

［3］郭志勤，張 沅，陳 東，等.家畜胚胎工程［M］.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1998，1－6.

［4］孫鳳俊，張新慧，等.奶牛超數(shù)排卵技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)奶牛，2007，35（1）：26－28.

［5］李劍軍.影響超數(shù)排卵的主要因素［J］.黃牛雜志，1998，24（4）：46－47.

［6］張 磊，冉汝俊.家畜超數(shù)排卵和胚胎移植的影響因素［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2000，2（4）：34－37.

［7］楊利國(guó)主編.動(dòng)物繁殖學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003，326－327.

［8］朱玉林，趙俊金.高效率超數(shù)排卵對(duì)供體奶牛的基本要求［J］.北京奶牛，1997，（4）：5－5.

［9］李建棟.淺析影響奶牛超排效果四項(xiàng)因素的研究［J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問，1997，25（3）：6－9.

［10］陳 亮.營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)延邊牛超排及胚胎質(zhì)量影響的研究［C］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)分會(huì)第五屆全體會(huì)議第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.2009，156－161.

［11］Armstrong D T.Factors affecting superovulationsuccess［J］.Embryo Transfer Newsletter，1991，（9）：11－17.

［12］張華林，楊利國(guó)，等.HMG和FSH用于安格斯牛超數(shù)排卵的效果比較［J］.中國(guó)奶牛，2012，30（1）：17－20.

［13］包呼格吉樂圖，韓錦龍，李樹靜，等.不同F(xiàn)SH制劑對(duì)肉牛超排效果比較［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，1999，7（1）：9－10.

［14］王 軍.西門塔爾牛超數(shù)排卵研究［J］.中國(guó)畜牧雜志，2008，44（23）：23－25.

［15］李 銘，吳柱月，等.不同F(xiàn)SH種類、劑量對(duì)不同種類肉牛超排效果的試驗(yàn)［J］.中國(guó)畜禽種業(yè)，2008，24（11）：18－20.

［16］秦殿武，王浩，王大廣，等.不同廠家FSH制劑對(duì)草原紅牛超排及預(yù)后效果觀察［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，2009，30（12）：3－4.

［17］楊煒峰.胚胎移植技術(shù)的現(xiàn)狀與展望［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2002，25（1）：29－33.

［18］王新莊，竇忠英，等.牛超排技術(shù)的研究［J］.黃牛雜志，1996，22（4）：20－23.

［19］喬海生，鈴木達(dá)行，Agung Budiyanto.CIDR結(jié)合 GnRH 在牛超數(shù)排卵中的應(yīng)用［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37（7）：26－27.

［20］曾 滔，張順利，等.維生素ADE在肉牛超數(shù)排卵中的應(yīng)用［J］.畜牧與獸醫(yī)，2007，39（4）：37－38.

［21］毛鳳顯.不同同期發(fā)情方法在受體牛處理中的應(yīng)用效果［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005，48（10）：23－24.

［22］Lowman B G Feeding in relation to suckler cow management and fertility［J］.Vet Rec，1985，117（4）：80－85.

［23］周順成，馬志遠(yuǎn)，尹世東.受體牛營(yíng)養(yǎng)對(duì)黃體的影響及黃體等級(jí)對(duì)凍胚移植受胎率影響的試驗(yàn)研究［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2006，37（4）：5－7.

［24］何光中，羅治華，羅啟華，等.提高飼養(yǎng)水平對(duì)黃牛同期發(fā)情效果的影響研究［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2002，26（6）：1－3.

［25］白雪蘭，嚴(yán)天元，肖春瑞，等.牛胚胎移植的主要操作技術(shù)及其影響因素［J］.中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2007，33（2）：40－42.