田會(huì)鵬，梁洪柱，李學(xué)燕，陳倩，寧少華，侯崢嶸

(北京市西山試驗(yàn)林場(chǎng)，北京 100093)

昆蟲病原線蟲寄主范圍廣，具有主動(dòng)搜索能力、高殺蟲力，對(duì)人畜、環(huán)境安全，能夠人工大量培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是害蟲生物防治中很有潛力的類群［1-3］。因此，用昆蟲病原線蟲防治農(nóng)林及牧草害蟲受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者及生產(chǎn)廠家的廣泛重視［4-5］。目前，美國(guó)、德國(guó)、澳大利亞、荷蘭、加拿大等國(guó)家的數(shù)十家商業(yè)化公司均可提供生產(chǎn)上應(yīng)用的昆蟲病原線蟲［6］。

在昆蟲病原線蟲生防產(chǎn)品的生產(chǎn)中，線蟲的大量繁殖是制約其商品化的瓶頸之一，由于昆蟲病原線蟲三角瓶培養(yǎng)過程繁瑣、占用空間大、產(chǎn)量小等原因?qū)е律a(chǎn)成本過高，在市場(chǎng)上無法與價(jià)格相對(duì)低廉的化學(xué)農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)［7-8］。本研究設(shè)計(jì)制造了昆蟲病原線蟲不銹鋼培養(yǎng)盒，試圖通過增加裝量來提高線蟲產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料 線蟲Steinernema carpocapsae A24和其共生菌Xenorhabdus nematophila。

培養(yǎng)容器為不銹鋼培養(yǎng)盒，35 cm×25 cm×20 cm，側(cè)面靠上部開突出圓口，可用紗布封口，以滿足培養(yǎng)過程產(chǎn)生的CO2、氨等不良?xì)怏w的排出。

共生菌培養(yǎng)液為牛肉膏、蛋白胨、蒸餾水等。

固體培養(yǎng)基(已申請(qǐng)專利保護(hù))成分主要有黃豆粉、面粉、蛋黃粉、蛋白胨、海綿、水等。

混合好的固體培養(yǎng)基分別以800，1 000，1 200，1 400 g/盒的量裝入培養(yǎng)盒中;以裝量80 g/瓶的500 mL三角瓶作為對(duì)照，121℃滅菌45 min后待用。1.2 接種方法 將Xenorhabdus nematophila接入共生菌培養(yǎng)液，搖床振蕩培養(yǎng)48 h。以0.1 mL/g的量接入配置好的線蟲固體培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)3 d后，以500條/g的量接入線蟲懸浮液，定期取樣檢測(cè)線蟲發(fā)育進(jìn)程［9］，培養(yǎng)21 d后收獲線蟲，不同處理重復(fù)4次。

1.3 分析方法

1.3.1 線蟲數(shù)量檢測(cè) 將盒內(nèi)培養(yǎng)好的線蟲連同共生菌和培養(yǎng)基浸泡于清水，線蟲通過篩網(wǎng)沉降出來，多次漂洗至無雜質(zhì)。再把線蟲稀釋若干倍后，搖勻，取1mL稀釋液在解剖鏡或光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3.2 線蟲侵染力的測(cè)定 采用沙埋法，將單頭健康高齡大蠟螟Galleria mellonella幼蟲放入塑料盒中，每盒放入消毒細(xì)沙80 g，滴入含100條侵染期線蟲的懸液，25℃條件下放置24 h后取出大蠟螟，轉(zhuǎn)置于25℃恒溫室，24 h后取出大蠟螟死蟲，解剖，用解剖鏡檢查進(jìn)入蟲體內(nèi)的線蟲數(shù)量，計(jì)算侵染率。當(dāng)線蟲的侵染率在7% ～10%左右，可認(rèn)為線蟲的質(zhì)量較好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)線蟲產(chǎn)量的影響 在培養(yǎng)后第22 d收獲并統(tǒng)計(jì)侵染期(IJ)線蟲的產(chǎn)量，通過圖1可以看出，800，1 000 g/盒2種處理中昆蟲病原線蟲產(chǎn)量較高，每克培養(yǎng)基線蟲含量均超過4.2×105條，1 000 g/盒處理與對(duì)照之間無顯著差異;而1 200 g/盒、1 400 g/盒2種處理每克培養(yǎng)基線蟲含量均低于3.6×105條，彼此間無顯著性差異，但同800 g/盒、1 000 g/盒、對(duì)照處理間差異顯著。

圖1 不同處理對(duì)線蟲產(chǎn)量的影響

2.2 不同處理對(duì)線蟲整齊度的影響 線蟲整齊度是考核線蟲規(guī)?；a(chǎn)成功與否的重要因子，只有整齊度高，在應(yīng)用時(shí)才能達(dá)到理想的防治害蟲的效果。收獲的IJ線蟲的整齊度見圖2。5個(gè)處理的線蟲整齊度均高于96%，其中800 g/盒，1 000 g/盒 2個(gè)處理與對(duì)照的線蟲整齊度超過98%。

2.3 不同處理對(duì)線蟲發(fā)育進(jìn)程的影響 在不同處理上各代線蟲的發(fā)育進(jìn)程存在差異，其中800 g/盒、1 000 g/盒處理的發(fā)育進(jìn)程較快，1 200 g/盒處理與對(duì)照發(fā)育歷期一致，1 400 g/盒處理中的接種代、F1代發(fā)育歷期與1 200 g/盒處理及對(duì)照一致，F(xiàn)2代的發(fā)育進(jìn)程最慢。詳見表1。

圖2 不同處理對(duì)線蟲整齊度的影響

表1 不同處理各代線蟲發(fā)育歷期的差異

2.4 不同處理對(duì)線蟲侵染力的影響 侵染力反映線蟲的毒力，是昆蟲病原線蟲質(zhì)量主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。不同處理培養(yǎng)的線蟲對(duì)大蠟螟的侵入能力測(cè)定結(jié)果表明:800，1 000，1 200 g/盒3個(gè)處理中線蟲的侵染率分別為 11.26%，12.32%，10.30%，與對(duì)照的11.77%無顯著差異，侵染能力較強(qiáng);1 400 g/盒處理(5.21%)與800，1 000，1 200g/盒、對(duì)照 4 個(gè)處理相比差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

3 討論

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)800 g/盒、1 000 g/盒 2個(gè)處理在線蟲產(chǎn)量、線蟲整齊度、線蟲發(fā)育進(jìn)程、線蟲侵染力方面都較好，與500 mL三角瓶的對(duì)照培養(yǎng)效果接近，從生產(chǎn)角度，同樣體積的培養(yǎng)盒盡可能多的培養(yǎng)線蟲考慮［10］，確定培養(yǎng)物裝量為1 000 g/盒最為理想，這個(gè)裝量是500 mL三角瓶裝量的12.5倍，線蟲培養(yǎng)效率提高很大，其最佳培養(yǎng)時(shí)間為18 d，比同樣條件下三角瓶培養(yǎng)縮短了2 d，且線蟲侵染力與三角瓶培養(yǎng)無顯著差異。

使用此方法進(jìn)行昆蟲病原線蟲的大量培養(yǎng)，提高了線蟲培養(yǎng)效率，節(jié)約了人工成本，有利于昆蟲病原線蟲的推廣使用。

［1］ 朱明軍，韓日疇，吳振強(qiáng)，等.斯氏線蟲生物反應(yīng)器液體培養(yǎng)的初步研究［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，27(3):83-87.

［2］ 游娟，梁世中，韓日疇.昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌胞內(nèi)晶體蛋白的研究進(jìn)展［J］.昆蟲天敵，2005，27(2):76-82.

［3］ 王立霞，楊懷文，黃大昉.昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌致病機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)報(bào)，2000，40(4):448-451.

［4］ 呂昌仁，馮善斌.應(yīng)用昆蟲病原線蟲防治意楊桑天牛的初步研究［J］.湖北林業(yè)科技，1995(2):35-36.

［5］ 楊秀芬，楊懷文.嗜線蟲桿菌接菌量對(duì)小卷蛾線蟲產(chǎn)量的影響［J］.中國(guó)生物防治，1997，13(4):163-165.

［6］ Kaya H K，Gaugler R.Entomopathogenic nematodes［J］.Annual Review of Entomology，1993，38:181-206.

［7］ 李慧萍，韓日疇.昆蟲病原線蟲感染寄主行為研究進(jìn)展［J］.昆蟲知識(shí)，2007，44(5):637-642.

［8］ 董圍偉，劉賢進(jìn)，余向陽，等.昆蟲病原線蟲研究概況［J］.昆蟲知識(shí)，2001，38(2):107-111.

［9］ 曾善玉，簡(jiǎn)恒，張善稿，等.不同培養(yǎng)基對(duì)線蟲質(zhì)量影響的統(tǒng)計(jì)分析［J］.數(shù)理統(tǒng)計(jì)與管理，1996，15(3):9-12.

［10］ 潘洪玉，丁利，王迎春，等.昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基的篩選和改進(jìn)［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17(4):16-19.