D-海因酶固定化的研究及展望

李海鳳，曾紅宇，許崗，楊兆勇

?

D-海因酶固定化的研究及展望

李海鳳，曾紅宇，許崗，楊兆勇

063000 唐山，河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（李海鳳）；410100 長(zhǎng)沙，湖南福萊格生物技術(shù)有限公司（曾紅宇、許崗）；100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究院（楊兆勇）

酶的固定化（enzyme immobilization）是將水溶性酶經(jīng)物理或化學(xué)方法處理后，成為不溶于水但具有酶活性的一種衍生物，在催化反應(yīng)中以固相狀態(tài)作用于底物。固定化酶因具有載體與酶結(jié)合的可逆及重復(fù)性[1]、粗酶液與載體結(jié)合的直接性[2]以及因恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合方式而產(chǎn)生的酶活性位點(diǎn)的充分暴露[3]等特質(zhì)而在生物催化領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

海因酶（hydantoinase，E.C.3.5.2.2）是一種重要的工業(yè)酶，根據(jù)其催化底物的不同光學(xué)活性，海因酶分為 D-型、L-型和 DL-型，其中 D-海因酶（二氫嘧啶酶）可選擇性催化 5-單替代海因或二氫嘧啶的開環(huán)，形成 N-氨甲酰-D-氨基酸產(chǎn)物，進(jìn)而經(jīng)化學(xué)或酶促降解產(chǎn)生相應(yīng)的 D-型氨基酸[4]。而 D-型氨基酸作為醫(yī)藥食品及化妝品領(lǐng)域的重要原料，被廣泛用于半合成抗生素、肽類激素、擬除蟲菊酯和農(nóng)藥的工業(yè)生產(chǎn)[4-5]。因此，利用 D-海因酶生產(chǎn) D-型氨基酸已成為手性產(chǎn)物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

D-海因酶大多是同型二聚體或四聚體，亞基分子量在 50~ 60 kD 之間，需要金屬離子作為輔因子。酶的活性易被一些螯合劑抑制，如 8-羥基-喹啉-5-硫酸。目前該類酶主要通過大腸桿菌產(chǎn)生，但其以溶液或凍干粉形式存在時(shí)均不穩(wěn)定，這在很大程度上限制了它們?cè)诠I(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[6]。

基于海因酶的研究現(xiàn)狀，本文將以對(duì) D-海因酶進(jìn)行固定化的常用載體為主線對(duì)該酶的固定化方式及未來研發(fā)趨勢(shì)作一概述。

1 D-海因酶的固定化方式

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，固定 D-海因酶的載體主要有各類樹脂及各類以網(wǎng)狀交聯(lián)為骨架的聚合物。樹脂類主要有聚苯乙烯（PS）陰離子交換樹脂、二乙基氨基乙基（DEAE）纖維素樹脂、Eupergit C、Eupergit C250L及其氨基樹脂、苯酚甲醛（PF）樹脂；聚合物類則以聚乙烯醇（PVA）和聚苯胺（PANI）為代表。此外，也有課題組應(yīng)用氨丙基玻璃珠（APG）和海藻酸鈣為載體對(duì) D-海因酶的固定化進(jìn)行研究。

1.1 聚苯乙烯樹脂

聚苯乙烯陰離子交換樹脂對(duì) D-海因酶的固定始見于 Jia 等[7]的報(bào)道，該種固定方式主要基于兩者間通過戊二醛形成的共價(jià)鍵，是“共價(jià)結(jié)合固定化法”的典型代表。該種方法制備的固定化酶呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，但參與共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基不應(yīng)是酶催化活性所必需的，否則會(huì)造成固定后酶活力的完全喪失。另一類應(yīng)用于 D-海因酶固定化的聚苯乙烯樹脂為 D92[8]。該樹脂來源廣泛，價(jià)格低廉，以該載體進(jìn)行的酶固定化制備與再生較為容易。經(jīng)該載體固定化后的 D-海因酶的m為游離酶的 1.8 倍，與離體酶比較，固定化后的 D-海因酶的作用溫度及適宜 pH 更寬，儲(chǔ)存及操作穩(wěn)定性大幅提高。

1.2 Eupergit C250L及其氨基化樹脂

馬哲等[9]和Ragnitz 等[10]以 Eupergit C250L及其氨基化樹脂為載體進(jìn)行了海因酶固定化研究。結(jié)果表明，基于 Eupergit C 系列固定化載體的固定化技術(shù)能夠保證 D-海因酶較高的酶活回收率，其中利用 Eupergit C250L為固定化載體，酶活的回收率可達(dá) 87%，半衰期長(zhǎng)達(dá) 2500 h，有較好的應(yīng)用前景，但由于載體價(jià)格較為昂貴，該方法的大規(guī)模應(yīng)用存在一定障礙。

1.3 二乙基氨基乙基（DEAE）纖維素樹脂

二乙基氨基乙基纖維素樹脂為一類通過交聯(lián)的方法對(duì) D-海因酶進(jìn)行固定的載體，最初見于 Rai 和 Taneja 的報(bào)道[11]。交聯(lián)法反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率較低，但適當(dāng)降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間有利于固定化酶比活力的提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二乙基氨基乙基纖維素樹脂對(duì) D-海因酶的酶活再生和酶再生的比率分別為 80% 和 86%。

1.4 海藻酸鈉

李全文等[12]應(yīng)用納米 Fe3O4協(xié)同海藻酸鈉固定化桑葉多酚氧化酶，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈣和氯化鈣的用量更少，包埋時(shí)間和交聯(lián)時(shí)間更短，相應(yīng)酶活回收率更高。而張佳寧等[13]以海藻酸鈉-殼聚糖為載體制備固定化磷脂酶 A2，具有工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、操作簡(jiǎn)便，而且固定化酶穩(wěn)固性較好。在20 世紀(jì)，Chevalier 等[14]已經(jīng)用海藻酸鈣來固定海因酶，現(xiàn)在可以對(duì)海藻酸鈣載體進(jìn)行改進(jìn)后再用于海因酶的固定。

1.5 其他

以網(wǎng)狀交聯(lián)為骨架的高分子聚合物因其高耐熱穩(wěn)定性、耐酸堿、比表面積大以及不易被微生物侵襲等特質(zhì)而在D-海因酶固定化載體領(lǐng)域備受青睞。Andrade 等[15]把聚苯胺作為海因酶固定化的載體時(shí)，固定化酶可以保持游離酶 80% 的酶活力，在 5 次循環(huán)反應(yīng)后仍能保持 55% 的酶活。陳建波和孫婧[16]將海因酶產(chǎn)生菌 SHNU01 包埋固定到聚乙烯醇（PVA）中。包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高，但是必須巧妙設(shè)計(jì)反應(yīng)條件，使之化學(xué)反應(yīng)時(shí)不至于破壞酶的活性部位和活性中心。

此外，Arcuri 等[17-18]將來源于 Vigna angularis 的海因酶固定到氨丙基玻璃珠上，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)。Ragnitz 等[19]感興趣的另一固定化介質(zhì)是水溶的碳化二亞胺，可與 EAH 瓊脂糖 4B 聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)以對(duì) D-海因酶的高活力保持為前提的高效固定化。

2 生物固定化及應(yīng)用前景

隨著酶的固定化方案及現(xiàn)代分子生物學(xué)理論的發(fā)展、完善與學(xué)科的交疊。一項(xiàng)稱為“生物固定化”的技術(shù)悄然興起。

20 世紀(jì)末，Linder 和Teeri[20]發(fā)現(xiàn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cellulose-binding domains，CBDs）可以特異地結(jié)合纖維素。并且，連接纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖維二糖水解酶的反應(yīng)速率比單純的纖維二糖水解酶的催化效率更高。依此，國(guó)內(nèi)外很多研究團(tuán)隊(duì)嘗試將待固定的酶通過連接區(qū)與 CBDs 連接，進(jìn)行融合表達(dá)，然后通過 CBDs 與纖維素的結(jié)合完成融合蛋白的固定化，開創(chuàng)了“生物固定化”的先河。

后續(xù)的研究者，如Chern 和 Chao[21]還陸續(xù)鑒定出該酶的不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域可分別與自然界中除了纖維素以外的幾丁質(zhì)[22]、殼多糖[23]等結(jié)合，更為廣泛的候選載體將大大拓展“生物固定化”這項(xiàng)新興技術(shù)的應(yīng)用潛能。

基于生物固定化酶所用的載體價(jià)廉易得、固定條件溫和無污染、對(duì)酶的毒性甚微且能維持其待固定酶的高度選擇性和良好的生物活性，我們對(duì)于該種固定化方式給予美好的期待，期望可以構(gòu)建能夠同時(shí)表達(dá)海因酶和 N-氨甲?；饷傅谋磉_(dá)載體，同時(shí)用現(xiàn)代高新技術(shù)對(duì)載體進(jìn)行修飾改性以及開發(fā)合成性能優(yōu)良的智能載體并進(jìn)行生物固定化，使實(shí)驗(yàn)室科研成果應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

[1] Salemuddin M. Bioaf?nity based immobilization of enzymes. Adv Biochem Eng Biotechnol, 1999, 64:203-226.

[2] Arcuri MB, Sabino SJ, Antunes OAC, et al. Kinetic study and produc-tion of N-Carbamoy-l D-Phenylglycine by immobilized D-Hydantoinase from vigna angularis. Catal Lett, 2002, 79(1-4):17- 19.

[3] Ko YM, Chen CI, Shieh CJ, et al. Simultaneous puri?cation and immobilization of D-hydantoinase on the immobilized metal af?nity membrane via coordination bonds. Biochem Eng J, 2012, 61:20-27.

[4] Syldatk C, May O, Altenbuchner J, et al. Microbial hydantoinases-- industrial enzymes from the origin of life. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 51(3):293-309.

[5] Ogawa J, Shimizu S. Industrial microbial enzymes: their discovery by screening and use in large-scale production of useful chemicals in Japan. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13(4):367-375.

[6] Hartley C, Kirchmann S, Burton S, et al. Production of D-amino acids from D,L-5-substituted hydantoins by an Agrobacterium tumefaciens strain and isolation of a mutant with inducer-independent expression of hydantoin-hydrolysing activity. Biotechnol Lett, 1998, 20(7):707-711.

[7] Jia HH, Ni F, Chen MJ, et al. The immobilization of D-hydantoinase and characterization under classic condition and microwave irradiation. J Mol Catalysis B Enzymatic, 2006, 43(1-4):74-79.

[8] Jia HH, Ni F, Wan YM, et al. Pilot study of D-hydantoinase immobilization by polystyrene resin. Chin J Bioprocess Eng, 2005, 3(2):41-44, 57. (in Chinese)

賈紅華, 倪芳, 萬永敏, 等. 聚苯乙烯樹脂固定化D-海因酶的初步研究. 生物加工過程, 2005, 3(2):41-44, 57.

[9] Ma Z, Yao Z, Zhu K, et al. Immobilization of hydantoinase from Burkholderic cepecia 1003. J Nanjing Univ Technol (Nat Sci Ed), 2005, 27(6):21-26. (in Chinese)

馬哲, 姚忠, 竺凱, 等. Burkholderic cepecia 1003產(chǎn)海因酶固定化條件. 南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 27(6):21-26.

[10] Ragnitz K, Syldatk C, Pietzsch M. Optimization of the immobilization parameters and operational stability of immobilized hydantoinase and l-N-carbamoylase from arthrobacter aurescens for the production of optically pure l-amino acids. Enzyme Microb Technol, 2001, 28(7-8): 713-720.

[11] Rai R, Taneja V. Production of D-amino acids using immobilized D-hydantoinase from lentil, Lens esculenta, seeds. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 50:658-662.

[12] Li QW, Yan D, Hou J, et al. Immobilization of polyphenol oxidase from mulberry leaf with sodium alginate and magnetic nanometer Fe3O4. Mod Chemical Industry, 2012, 32(10):58-61. (in Chinese)

李全文, 嚴(yán)東, 侯杰, 等. 納米Fe3O4協(xié)同海藻酸鈉固定化桑葉多酚氧化酶. 現(xiàn)代化工, 2012, 32(10):58-61.

[13] Zhang JN, Song YH, Wang Y, et al. Study on phospholipase A2 immobilized by sodium alginate-chitosan. Sci Technol Food Industry, 2012, 33(21):201-205, 209. (in Chinese)

張佳寧, 宋云花, 王玥, 等. 海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的研究. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(21):201-205, 209.

[14] Chevalier P, Roy D, Morin A. Hydantoinase activity of immobilized non-growing Pseudomonas putida cells. Appl Microbiol Biotechnol, 1989, 30:482-486.

[15] Andrade JM, Peres RCD, Oestreicher EG, et al. Immobilization of d-hydantoinase in polyaniline. J Mol Catalysis B Enzymatic, 2008, 55(3-4):185-188.

[16] Chen JB, Sun J. Study on the immobilization of D-hydantoinase- producing strains by entrapment. J Biol, 2012, 29(1):33-36. (in Chinese)

陳建波, 孫婧. 海因酶產(chǎn)生菌SHNU01的包埋固定化研究. 生物學(xué)雜志, 2012, 29(1):33-36.

[17] Arcuri MB, Antunes OA, Machado SP, et al. Stability of immobilized D-hydantoinase from Vigna angularis and repeated cycles of highly enantioenriched production of N-carbamoyl-D-phenylglycines. Amino Acids, 2004, 27(1):69-74.

[18] Arcuri MB, Sabino SJ, Antunes OAC, et al. Kinetic study and production of N-carbamoyl-D-phenylglycine by immobilized D-hydantoinase from Vigna angularis. Catal Lett, 2002, 79(1-4): 17-19.

[19] Ragnitz K, Pietzsch M, Syldatk C. Immobilization of the hydantoin cleaving enzymes from Arthrobacter aurescens DSM 3747. J Biotechnol, 2001, 92(2):179-186.

[20] Linder M, Teeri TT. The cellulose-binding domain of the major cellobiohydrolase of Trichoderma reesei exhibits true reversibility and a high exchange rate on crystalline cellulose. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(22):12251-12255.

[21] Chern JT, Chao YP. Chitin-binding domain based immobilization of D-hydantoinase. J Biotechnol, 2005, 117(3):267-275.

[22] Cheng SW, Wei W, Cheng XH, et al. Penicillin G acylase immobilized with crosslinked mixture of glutaraldehyde and chitin and its characteristic. Food Drug, 2010, 12(11):392-396. (in Chinese)

程仕偉, 尉文, 程顯好, 等. 戊二醛交聯(lián)幾丁質(zhì)固定化青霉素G?；讣捌湫再|(zhì)研究. 食品與藥品, 2010, 12(11):392-396.

[23] Li W, Cao H, Gao J, et al. Study on immobilization of allinase from onion by chitosan microspheres with absorption and cross-linking method. Sci Technol Food Industry, 2012, 33(24):215-218, 222. (in Chinese)

李衛(wèi), 曹紅, 高佳, 等. 殼聚糖微球吸附-交聯(lián)法固定洋蔥蒜氨酸酶的研究. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(24):215-218, 222.

國(guó)家自然科學(xué)基金（81172965）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（2012N09）

許崗，Email：wangpeng@hnflag.com；楊兆勇，Email：zhaoyongy@163.com

2013-01-28

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.013