抗狂犬被動(dòng)免疫制劑研究進(jìn)展

金晶，孫麗娜，梁米芳

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抗狂犬被動(dòng)免疫制劑研究進(jìn)展

金晶，孫麗娜，梁米芳

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

狂犬病是由狂犬病毒（rabies virus，RV）引起的人畜共患疾病，一旦感染，如不及時(shí)采取有效防治措施，其病死率接近 100%?？袢〉谋┞逗箢A(yù)防（post-exposure prophylaxis，PEP）是防治狂犬病的主要措施。為獲得快速的保護(hù)作用，世界衛(wèi)生組織建議，對(duì)于嚴(yán)重暴露者應(yīng)同時(shí)使用注射狂犬疫苗和狂犬病毒免疫球蛋白（rabies immune globulin，RIG）進(jìn)行主動(dòng)和被動(dòng)免疫治療[1]。

狂犬病毒屬于彈狀病毒科（）狂犬病毒屬（），其基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈 RNA?；蚪M的 3' 端至 5' 端依次排列著 N、P、M、G 和 L 共5 個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和轉(zhuǎn)錄酶大蛋白（L）。糖蛋白（G）是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原，也是能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的唯一抗原，在病毒致病和機(jī)體免疫過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。研究顯示，糖蛋白上至少存在 3 個(gè)主要的中和抗體結(jié)合位點(diǎn)：抗原位點(diǎn) I、II 和III[3]，其中抗原位點(diǎn) I 為線(xiàn)性表位，抗原位點(diǎn) II 和III 為空間構(gòu)型表位。抗原位點(diǎn) III 第 333 位精氨酸被認(rèn)為是影響毒力的關(guān)鍵殘基，其改變通常導(dǎo)致狂犬病毒毒力的丟失。一些狂犬病毒糖蛋白抗體能有效中和狂犬病毒，保護(hù)嚙齒類(lèi)動(dòng)物抵抗致死劑量狂犬病毒的感染[4]，因此，針對(duì)狂犬病毒糖蛋白被動(dòng)免疫制劑的研究，對(duì)于促進(jìn)狂犬病毒的機(jī)制研究和狂犬病毒的臨床治療都有重要意義。

1 抗血清

對(duì)于狂犬病毒暴露者，接種疫苗 7 ~ 10 d 后才能產(chǎn)生中和抗體，在中和抗體未產(chǎn)生或抗體效價(jià)較低時(shí)，注射抗血清以抵御病毒侵襲就顯得尤為重要。目前，市場(chǎng)上商品化的抗狂犬病毒被動(dòng)免疫制劑都分離自免疫血清，根據(jù)其來(lái)源不同，分為人抗狂犬病毒免疫球蛋白（human rabies immune globulin，HRIG）和馬抗狂犬病毒免疫球蛋白（equine rabies immune globulin，ERIG），如 Bayer 公司的人免疫球蛋白（BayRabTM）、巴斯德公司的馬源抗狂犬病毒血清（ERIG PMC）以及北京生物制品研究所和武漢生物制品研究所生產(chǎn)的馬源抗狂犬病毒血清。通常 HRIG 的使用劑量為20 IU/kg，ERIG 的使用劑量為 40 IU/kg，與疫苗聯(lián)用保護(hù)率接近 100%[5]。我國(guó)的馬抗狂犬病毒血清是用狂犬病毒作為抗原免疫馬匹后，經(jīng)測(cè)試血清抗體效價(jià)達(dá)到 100 IU/ml 時(shí)采集血漿，加入胃蛋白酶切除 Fc 段，并經(jīng)一系列純化工藝而成為商品[6]。由于 ERIG 有較重的副反應(yīng)，而且對(duì)某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制作用，美國(guó)免疫實(shí)踐咨詢(xún)委員會(huì)（ACIP）建議優(yōu)先選用 HRIG[7-8]。但由于 HRIG 來(lái)源少，價(jià)格高，且存在潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)，在狂犬病暴露后治療中的應(yīng)用也受到了限制。而無(wú)論 HRIG 還是 ERIG，其供應(yīng)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足狂犬病毒流行地區(qū)尤其是狂犬病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家的需求，因此尋找可靠的 RIG 替代品是目前研究的首要目標(biāo)。

2 鼠源單克隆抗體

迄今為止，雜交瘤技術(shù)仍是最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的抗體制備技術(shù)。它的發(fā)展經(jīng)歷了早期的鼠源雜交瘤單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）9-10]和后期的人源雜交瘤單克隆抗體[11-12]兩個(gè)階段。1978 年，Wiktor 和 Koprowski 等[13]首次通過(guò) B 淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)獲得了能夠保護(hù)動(dòng)物抵抗致死性狂犬病毒攻擊的抗狂犬病毒單克隆抗體，此后多種抗狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體相繼問(wèn)世。1989 年，Schumacher 等[14]首次將狂犬病毒特異性的鼠源單克隆抗體制備成抗體雞尾酒，在對(duì)攻毒小鼠及倉(cāng)鼠的 PEP 中都顯示了良好的保護(hù)性。“單克隆抗體雞尾酒”療法（cocktail of anti-rabies McAb，McAb-C）指利用狂犬病毒特異性單克隆抗體尤其是中和抗體替代狂犬病毒抗血清用于狂犬病的暴露后治療。將不同表位的 mAbs 聯(lián)用，既能起到類(lèi)似多克隆免疫球蛋白的效果，又保留了 mAbs 特異性強(qiáng)和同質(zhì)性高的優(yōu)點(diǎn)[15]。1992 年，Dietzschold 等[16]發(fā)現(xiàn)對(duì)于受狂犬病毒攻擊的小鼠，鼠源單克隆抗體 mAb1112-1 與 RIG 保護(hù)效力相當(dāng)，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)已被狂犬病毒侵入的小鼠，mAb1112-1 也具有一定的保護(hù)能力。2007 年，Muhamuda 等[17]獲得了多株針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的鼠源性單克隆抗體，其中和滴度及蛋白活性高于市場(chǎng)上的 ERIG 2000 倍，有望進(jìn)一步研究以應(yīng)用于人群暴露后預(yù)防。為使治療性抗狂犬病毒抗體能在發(fā)展中國(guó)家得到更廣泛的應(yīng)用，Müller 等[15]于 2009 年開(kāi)發(fā)了一種由 5 株鼠源單克隆抗體（E559.9.14、1112-1、62-7-13、M727-5-1 和 M777-16-3）組成的抗體雞尾酒，其中 4 株抗體針對(duì)抗原位點(diǎn) II，1 株針對(duì)抗原位點(diǎn) III。用這 5 株抗體所組合成的 3 組抗體雞尾酒進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，對(duì)攻毒倉(cāng)鼠的保護(hù)率可達(dá)到 66% ~ 100%，均高于同等實(shí)驗(yàn)條件下的 HRIG 對(duì)照組（44%），因此有希望取代 HRIG 進(jìn)行狂犬病毒暴露后預(yù)防。

不過(guò)鼠源性單克隆抗體在體內(nèi)易被清除，可誘發(fā)人體產(chǎn)生人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA）或引起過(guò)敏反應(yīng)，且鼠源性 Fc 段功能不能有效發(fā)揮，這些問(wèn)題都使其在人體內(nèi)的應(yīng)用受到了局限，因此將鼠源單克隆抗體應(yīng)用于臨床狂犬病的預(yù)防治療需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)密的篩選和實(shí)驗(yàn)。

3 基因工程抗體

基因工程抗體技術(shù)屬于第三代抗體技術(shù)，其內(nèi)容主要包括兩部分，一是對(duì)已有的單克隆抗體進(jìn)行改造，包括通過(guò)制備嵌合抗體和 CDR 移植抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)抗體人源化、制備小分子抗體（Fab、ScFv、dsFv、diabody、minibody 等）和抗體融合蛋白；二是通過(guò)抗體庫(kù)技術(shù)獲得人源單抗。基因工程抗體的發(fā)展使得人源及人源化抗體的大量制備成為可能。

3.1 人源單克隆抗體

Dietzschold 等[12]于 1990 年獲得的針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的單克隆抗體 Mab57 是目前研究最為深入的人源雜交瘤單克隆抗體。Mab57 來(lái)自免疫后人外周血 B 淋巴細(xì)胞，經(jīng)重組病毒表達(dá)系統(tǒng)在 BSR 細(xì)胞中制備，特異性針對(duì)抗原位點(diǎn)I（KLCGVL），能夠高效和廣泛地中和狂犬病毒，并對(duì)受狂犬病毒攻擊的嚙齒動(dòng)物起保護(hù)作用。1991 年，Enssle 等[18]制備了特異性針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的人源抗體 McAb TW-1，其在體外試驗(yàn)（RFFIT）和體內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)受試小鼠均表現(xiàn)出良好的保護(hù)能力。2000 和 2001 年，Champion等[19]和 Hanlon 等[20]分別獲得針對(duì)未知位點(diǎn)的 Mab JA 及針對(duì)抗原位點(diǎn)II的 Mab JB。2003 年，Prosniak 等[4]對(duì) Mab57、Mab JB 及 Mab JA 進(jìn)行基因重組并在彈狀病毒載體中表達(dá)，命名為 SO57、SOJA 及 SOJB，并將它們組成抗體雞尾酒，對(duì)接受致死劑量狂犬病毒攻擊的小鼠和倉(cāng)鼠，僅接受一次抗體雞尾酒的治療即可顯示出保護(hù)作用，在小鼠模型中運(yùn)用該抗體雞尾酒進(jìn)行 PEP 可得到與 HRIG 相同的保護(hù)效力。2005 年，Marissen 等[21]通過(guò) PER.C6 系統(tǒng)對(duì)這 3 株抗體進(jìn)行改造，經(jīng)由 BHK 或 CHO 細(xì)胞系表達(dá)，改名為CR57、CRJA 和 CRJB，結(jié)果顯示，CRJA 中和活性較弱，而 CR57 和 CRJB 識(shí)別的抗原位點(diǎn)存在重疊，因此這3 株抗體不適合同時(shí)用于抗體雞尾酒的調(diào)制。同年，Kramer 等[22]將從人源免疫庫(kù)獲得的 VH 和 VL 基因克隆入 PDV-C06 載體，并通過(guò)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行篩選，得到一株針對(duì)抗原位點(diǎn)III的 scFv 形式的抗體 CR4098，這株抗體具有廣泛的中和譜和與 CR57 互補(bǔ)的良好的中和活性。2006 年，Goudsmit 等[23]用 CR57 和 CR4098 制備抗體雞尾酒，并同 HRIG 進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果表明 CR57/ CR4098 MAbs 能中和 26 株狂犬街毒株，20 IU/kg 的CR57/CR4098 與疫苗聯(lián)用對(duì)受試小鼠保護(hù)率為 100%，同等劑量 HRIG 與疫苗聯(lián)用保護(hù)率約為 92%，CR57/CR4098 表現(xiàn)出與 HRIG 相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)能力，證明了重組人源抗狂犬單克隆抗體替代抗血清是可行的。由 Crucell 公司開(kāi)發(fā)的 CR57 和 CR4098 構(gòu)成的單克隆抗體雞尾酒 CL184 已經(jīng)于 2008 年在美國(guó)和印度完成了 I 期臨床，CL184 在疫苗注射后的免疫應(yīng)答中表現(xiàn)出了良好的耐受性，且無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生[24]；根據(jù)最新研究結(jié)果顯示，CL184 的II期臨床試驗(yàn)已經(jīng)在美國(guó)和菲律賓完成，III期臨床試驗(yàn)正在印度進(jìn)行評(píng)估，距投入市場(chǎng)已不再遙遠(yuǎn)[25]。

2007 年，Sloan 通過(guò)可表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備了針對(duì)抗原位點(diǎn)III的人源單克隆抗體 17C7，17C7 具有廣泛的中和譜，由馬薩諸塞州生物實(shí)驗(yàn)室（MBL）和美國(guó) CDC 合作完成的臨床前實(shí)驗(yàn)顯示，17C7 在劑量為 21、5 和 0.2 IU/kg 時(shí)對(duì)倉(cāng)鼠的保護(hù)率分別為 95%、89% 和 89%，而 HRIG 在劑量為 37 IU/kg 時(shí)對(duì)倉(cāng)鼠的保護(hù)率為 95%，提示在倉(cāng)鼠模型中使用與 HRIG 相同或更低劑量的 17C7 即可達(dá)到與 HRIG 相同的保護(hù)效力[26]；由 MBL 和印度血清學(xué)會(huì)共同贊助的I期臨床試驗(yàn)已在印度完成，其在成人體內(nèi)的安全性有待進(jìn)一步評(píng)估[27]。2008，Nagarajan 等[28]通過(guò)免疫人的永生 B 細(xì)胞系獲得單克隆抗體 R16F7 和 R14D6，用這兩株抗體進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)（使用劑量為 20 IU/kg），結(jié)果顯示這兩株抗體無(wú)論是單獨(dú)與疫苗聯(lián)用還是組成抗體雞尾酒與疫苗聯(lián)用，都能對(duì)受試動(dòng)物起到保護(hù)作用。2009 年，Houimel 和 Dellagi[29]通過(guò)構(gòu)建人源抗狂犬病毒 Fab 噬菌體抗體庫(kù)，篩選獲得了 6 株 Fab 抗體，其中 3 株特異性針對(duì)狂犬病毒糖蛋白III號(hào)位點(diǎn)。2010 年，Matsumoto 等[30]利用抗體庫(kù)技術(shù)篩選到單克隆抗體 huMAbs No.254 和 4D4，huMAbs No.254 屬于 IgG3 亞類(lèi)且特異性針對(duì)抗原位點(diǎn)III，4D4 為 IgM 型抗體，其識(shí)別位點(diǎn)位于狂犬病毒糖蛋白抗原位點(diǎn)I和IV之間的某個(gè)區(qū)域。體內(nèi)試驗(yàn)中，1 IU/kg 劑量的 No.254 可對(duì)小鼠有 50% 的保護(hù)率，略遜于同等劑量下 ERIG 對(duì)小鼠的保護(hù)率（70%）。2012 年，Sun 等[31]利用 pComb 3H 噬菌體抗體庫(kù)系統(tǒng)篩選到 5 株針對(duì)位點(diǎn)II的 Fab 抗體，這 5 株抗體均屬于 IgG1 亞類(lèi)，在體外試驗(yàn)（RFFIT）和體內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)受試小鼠均表現(xiàn)出良好的保護(hù)能力。2012 年，重組人源抗狂犬單克隆抗體 SII RMAb 已在印度完成為期一年的I期臨床試驗(yàn)[32]。以上結(jié)果均表明人源單克隆抗體安全有效，且保護(hù)率與 RIG 相當(dāng)，可取代 RIG 用于暴露后預(yù)防。

3.2 抗體改造及親和力成熟

小分子抗體因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小、穿透性強(qiáng)、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而備受人們關(guān)注，基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展使各種小分子抗體的構(gòu)建和表達(dá)成為可能?？袢《緩闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的清除機(jī)制與體內(nèi)病毒的清除機(jī)制不同[33]，而小分子抗體（如 Fab）通過(guò)血-腦脊液屏障的能力強(qiáng)于全抗體，因此有可能將狂犬病毒從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中清除[16,34]。scFv 是目前研究最廣泛的一種小分子抗體，Yokota 等[35]發(fā)現(xiàn) scFv 可以穿透遠(yuǎn)處腫瘤組織和血-腦脊液屏障這種特性可用于狂犬病毒急性感染的治療。針對(duì)小分子抗體在血液中不穩(wěn)定的特點(diǎn)，研究人員嘗試通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)抗體分子進(jìn)行各種形式的改造來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。王丁丁等[36]通過(guò)畢赤酵母人抗狂犬病毒抗體 scFv-Fc 分泌表達(dá)文庫(kù)篩選獲得具有較高親和力的 scFv-Fc 抗體。Duan 等[37]在 scFV-57 的VH44 位及 VL100 引入 Cys 形成 ds-FV57，并將 VL85 位的 Cys 突變?yōu)?Ser，結(jié)果顯示，相較于 scFV-57，ds-FV57VL85Ser的穩(wěn)定性和體外中和能力都得到了很大提升。

4 展望

雖然到目前為止，還沒(méi)有任何一種治療性抗狂犬單克隆抗體實(shí)現(xiàn)商品化，但許多研究已進(jìn)入臨床前實(shí)驗(yàn)或臨床觀察階段。與此同時(shí)，針對(duì)抗狂犬被動(dòng)免疫制劑大規(guī)模生產(chǎn)的研究也取得一定進(jìn)展，研究人員已通過(guò)利用動(dòng)物細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因植物等獲得了狂犬單克隆抗體及多克隆抗體的高效表達(dá)；在我國(guó)，華北制藥集團(tuán)已經(jīng)得到高水平表達(dá)人源化抗狂犬單抗HuMAbs（NM57）的工程細(xì)胞株，具備一定的生產(chǎn)能力。隨著研究的繼續(xù)和深入，各種新型抗狂犬被動(dòng)免疫制劑的商品化生產(chǎn)將成為可能，人源單克隆抗體及單克隆抗體雞尾酒有望很快取代人 HRIG 和 ERIG 應(yīng)用于臨床治療。

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2013-01-23

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梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com