CD82／KAI1在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)

唐 甜 陜 光 陳小希

（1武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，2武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科，湖北430060；3湖北省地質(zhì)職工醫(yī)院，武漢430072）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在膀胱癌中，90%以上是尿路上皮癌。超過70%的尿路上皮癌在治療后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)腫瘤中約30%出現(xiàn)惡性度增加。全球發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，全球每年約有35．6萬新增病例，發(fā)病率位居所有腫瘤的第9位［1］。膀胱癌的浸潤和轉(zhuǎn)移與多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)、調(diào)控以及細(xì)胞凋亡有關(guān)［2］，早期做出正確的診斷對疾病的治療與預(yù)后有重要的臨床意義。

腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移是多基因、多因子共同作用的結(jié)果。KAll／CD82基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，KAll／CD82蛋白屬于4次跨膜超家族（transmembrane4superfamily，TM4SF），通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附，抑制腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，而起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［3，4］。

我們通過免疫組織化學(xué)方法試圖探討CD82／KAII與膀胱移行細(xì)胞癌的關(guān)系，以期能進(jìn)一步闡明膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理，尋找早期預(yù)測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測提供一定的參考依據(jù)。

材料和方法

1．材料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2006－2010年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學(xué)證實為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50．3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3－5cm。標(biāo)本均經(jīng)HE染色，光鏡觀察診斷，按 WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類（2004），浸潤性尿路上皮癌30例，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌；高級別15例，低級別5例；按UICC臨床分期，T1期31例，T2期11例，T3－4期8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。

2．方法

HE染色 常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

3．主要試劑

即用型兔抗人CD82／KAI1多克隆抗體；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒；DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

4．免疫組織化學(xué)SP法檢測CD82／KAI1相關(guān)抗原

具體步驟：5μm 組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3min；抗原修復(fù)，室溫自然冷卻后，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗5×3min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3 min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育10min，0．01mol／L PBS（pH 7．4）漂洗3×3min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時間（約3－5min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0．1%氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為CD82／KAI1的陽性對照組。

5．免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

5．1CD82／KAI1以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

5．2采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對CD82／KAI1的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

6．統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)處理 對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α為0．05。

結(jié) 果

CD82∕KAI1的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌細(xì)胞內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，CD82／KAI1呈陰性表達(dá)（圖1）；癌旁組織細(xì)胞內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，CD82／KAI1呈陽性表達(dá)（圖2）。圖像分析結(jié)果見表。經(jīng)q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，CD82／KAI1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0．05）（表1）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織CD82／KAI1表達(dá)的平均光密度和陽性面積率±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of CD82／KAI1 in Bladder Urothelial Cancer and Para－cancertissue（ˉx±s）

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織CD82／KAI1表達(dá)的平均光密度和陽性面積率±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of CD82／KAI1 in Bladder Urothelial Cancer and Para－cancertissue（ˉx±s）

＊ 膀胱移行細(xì)胞癌與癌旁組織比較（comparison between Bladder Urothelial Cancer andPara－cancertissue），P＜0．05

組別Group例數(shù)n平均光密度Average optical densit陽性面積率Rate of positive area膀胱尿路上皮癌 50 0．0591±0．0021 0．0562±0．0020 Bladder Urothelial Cancer癌旁組織 5 0．2874±0．0074 0．2720±0．0066 Para－cancer tissue

圖1 KAl1／CD82的表達(dá)：膀胱尿路上皮癌組 胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，KAl1／CD82呈陰性表達(dá)（→）。HE×200圖2 KAl1／CD82的表達(dá)：癌旁組織 細(xì)胞核和胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，KAl1／CD82呈陽性表達(dá)（→）。HE×200Fig．1The expression of KAl1／CD82：bladder urothelialcancer group：There were few brown particles in thenucleus or cytoplasm，which showed KAl1／CD82expressed negative．HE×200Fig．2The expression of KAl1／CD82：cancer side tissue：There were plenty of brown particles in thenucleus or cytoplasm，which showedKAl1／CD82expressed positive．HE×200

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前發(fā)病率呈上升趨勢，且復(fù)發(fā)率高，易產(chǎn)生獲得性耐藥。膀胱癌初發(fā)時80%為淺表性，其中70%術(shù)后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)者30%向高級高期發(fā)展，15%－30%的患者初發(fā)時即具有侵襲性，即使經(jīng)過治療，也較早轉(zhuǎn)移。因此，研究與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)理，尋找早期預(yù)測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測提供一定的參考依據(jù)具有重要的臨床意義。

人類CD82／KAl1基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，定位于染色體1lpl12上，CD82／KAl1cDNA長2．4kb，編碼含有267個氨基酸的蛋白質(zhì)，其分子量為29．61kD。CD82／KAl1蛋白屬于4次跨膜超家族（TM4SF），主要存在于白細(xì)胞和其它組織細(xì)胞表面［5－8］，膜內(nèi)則有較短的氨基和羧基尾巴。CD82／KAl1基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附，抑制腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，而起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。CD82／KAl1在機(jī)體大多數(shù)組織中表達(dá)，分布廣泛，如前列腺、肝、肺、脾、骨髓、胎盤等組織表達(dá)豐富，乳腺、胰腺、骨 骼 肌、胸 腺 等 也 可 見［9－12］。 目 前，盡 管 對CD82／KAl1蛋白的生物學(xué)功能仍不完全清楚，但其在上皮細(xì)胞膜上的定位和廣泛的糖基化提示，CD82／KAl1蛋白參與細(xì)胞間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的反應(yīng)，這兩種反應(yīng)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起相當(dāng)重要的作用［13－15］。近年來的研究證實 CD82／KAl1基因表達(dá)下降或缺失與人類胰腺癌、胃癌及食管癌、前列腺癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)；隨著腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成與發(fā)展，其表達(dá)逐漸下降或缺失，表明CD82／KAl1基因可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

我們采用免疫組織化學(xué)的方法，對膀胱尿路上皮癌組織中CD82／KAI1的表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在探討它們與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果表明：CD82／KAI1在膀胱尿路上皮癌中呈低表達(dá)，癌旁組織中呈高表達(dá)。原因可能為：CD82／KAI1基因高表達(dá)是腫瘤發(fā)生發(fā)展中常見的早期分子事件，CD82／KAI1基因在惡性程度高的膀胱尿路上皮癌中低表達(dá)而失去了其作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制的作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。CD82／KAI1基因的異常表達(dá)可能腫瘤發(fā)生有關(guān) 這可能對腫瘤的早期診斷有幫助，也可將CD82／KAI1蛋白表達(dá)水平可作為評估膀胱尿路上皮癌的轉(zhuǎn)移潛能、間接判斷預(yù)后的一個指標(biāo)。

［1］Yakasai A，Allam M，Thompson AJ，et al．Incidence of bladder cancer in a one－stop clinic．Ann Afr Med，2011，10（2）：112－114

［2］Peck JR，Hitchcock CL，Maguire S，et al．Isolated cardiac metastasis from plasmacytoidurothelial carcinoma of the bladder．Eur Urol，2012，27（12）：1414－1421

［3］Knoener M，Krech T，Puls F，et al．Limited value of KAI1／CD82protein expression as a prognostic marker in human gastric cancer．Dis Markers，2012，32（6）：337－342

［4］Wei X，Liu S，Wang X，et al．CD82expression alters with human endometrial cycles and affects the uterine endometrial receptivity in vitro．ExpBiol Med （Maywood），2012，237（3）：254－262

［5］Mooez S，Malik FA，Kayani MA，et al．Expressional alterations and transcript isoforms of metastasis suppressor genes （KAI1and KiSS1）in breast cancer patients．Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（10）：2785－2791

［6］Nazir M，Kayani MR，Malik FA，et al．Lack of germ line changes in KISS1and KAI1genes in sporadic head and neck cancer patients of Pakistani origin．Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（10）：2767－2771

［7］Wu S，Cheng Z，Yu L，et al．Expression of CD82／KAI1and HIF－1αin non－small cell lung cancer and their relationship to vasculogenic mimicry．J Oral Pathol Med，2011，14（12）：918－925

［8］Wang H，Zhang W，Zhao J，et al．N－Glycosylation pattern of recombinant human CD82 （KAI1），a tumor－associated membrane protein．FEBSLett，2011，585（20）：3166－3173

［9］Tsai YC，WeissmanAM．Dissecting the diverse functions of the metastasis suppressor CD82／KAI1．Cell Physiol－Biochem，2011，27（5）：575－586

［10］Lee HA，Park I，Byun HJ，et al．Metastasis suppressor KAI1／CD82attenuates the matrix adhesion of human prostate cancer cells by suppressing fibronectin expression andβ1integrin activation．J Mol Endocrinol，2011，47（2）：195－208

［11］Li MQ，Hou XF，Lv SJ，et al．CD82gene suppression in endometrial stromal cells leads to increase of the cell invasiveness in the endometrioticmilieu．Int J Clin Exp Pathol，2011，4（3）：276－286

［12］Nagao K，Oka K．HIF－2directly activates CD82gene expression in endothelial cells．Infect Immun，2011，79（3）：1098－1106

［13］Bari R，Zhang YH，Zhang F，et al．Transmembrane interactions are needed for KAI1／CD82－mediated suppression of cancer invasion and metastasis．Int J Cancer，2009，124（9）：2243－2244

［14］Geradts J．Re：KAI1／CD82is a novel target of estrogen receptor－mediated gene repression and downregulated in primary human breast cancer．Cell Biochem Funct，2009，27（1）：40－47

［15］MirantiCK．Controlling cell surface dynamics and signaling：how CD82／KAI1suppresses metastasis．Int J Cancer，2008，15，123（10）：2239－2246