EZH2在胃癌組織中的表達及與Hp－L型感染關系的探討

趙淑芳 于東紅

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學院病理學教研室，安徽233004）

EZH2是PcG（polycomb group）基因家族的核心成員，是果蠅zeste基因增強子的人類同源基因。EZH2通過抑制染色質中的靶基因控制細胞的記憶系統(tǒng)，從而促進細胞的增殖和擴散，與腫瘤的惡性程度和患者的預后密切相關［1－2］。幽門螺桿菌L型（Helicobacter pylori－L）是幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）的細胞壁缺陷型。Hp可在胃液、膽汁、溶菌酶、抗生素等因素作用下發(fā)生細胞壁缺陷而形成Hp－L型。因多為球形幽門螺桿菌，故又稱球形。已知Hp－L型的生物學性狀和致病性與原菌有相似之處，也有明顯不同，且與胃癌的發(fā)生有一定關系。目前國內外對EZH2蛋白在胃癌組織中的表達及意義以及EZH2與幽門螺桿菌及其L型感染相關性的研究報道較少，為此我們應用免疫組織化學、革蘭染色和RT－PCR方法檢測胃癌組織及其切緣組織中EZH2蛋白的表達、Hp及其L型感染的情況，旨在探討胃癌EZH2的表達及臨床意義，以及EZH2與Hp－L型感染的相關性。

材料和方法

1．一般資料

1．1收集2012年2月至2012年5月胃癌手術的新鮮標本30例（有轉移的）及新鮮的遠端正常組織（距腫瘤邊緣組織約5cm處），術前未行放、化療治療，所有胃癌組織均在離體30min內切取，其中男性21例，女性9例，年齡55－79歲，中位年齡64歲，所有患者臨床資料完整，病理資料均由2名病理主治醫(yī)師復習。

1．2收集蚌埠醫(yī)學院病理學教研室2010年12月－2011年6月外檢檔案中胃癌手術標本80例，其中男性60例，女性20例；年齡34－87歲，中位年齡60歲。組織學分級Ⅰ級＋Ⅱ級（高分化＋中分化）45例，Ⅲ級（低分化＋未分化）35例；有淋巴結轉移者13例，無淋巴結轉移者67例；癌組織未浸潤至漿膜層11例，浸潤至漿膜層69例；按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）公布的TNM分期標準（2002年，第6版）進行分期：Ⅰ－Ⅱ期44例，Ⅲ－Ⅳ期36例。在該組病例中，隨機選取30例胃癌兩端切緣組織為正常對照。所有病例均滿足如下標準：1）組織塊按常規(guī)經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋，4μm連續(xù)切片數(shù)張；2）所有病例術前均未接受放療或化療；3）外科治療均為根治性切除，存在無瘤切緣；4）病理診斷依據(jù)第4版WHO胃癌組織學分類標準。除做常規(guī)HE染色外，余做革蘭染色、免疫組織化學染色。EZH2（多克隆）購于北京中杉金橋生物技術有限公司，ElivisionTMplus免疫組化試劑盒，購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。Trizol Reagent（Invitrogen）、逆轉錄試劑盒、Marker、DEPC（Sigma）、瓊脂糖、TBE等購自合肥志宏生物技術有限公司，EZH2基因引物、β內參引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成。

2．方法

2．1EZH2檢測

2．1．1采用免疫組化Elivision法：組織切片進行微波抗原修復，具體操作按說明書方法進行。用已知陽性片為陽性對照；用PBS替代一抗為陰性對照。結果判斷：EZH2陽性顯色以癌細胞胞核呈棕黃色顆粒為主，雙盲法對染色結果進行評估，每例隨機觀察5個高倍視野（×400），每高倍視野計數(shù)100個瘤細胞。采用半定量積分法，將染色強度分為3級：無著色1分，淺著色2分，棕黃色3分；按陽性瘤細胞的百分比分3級：≤25%為Ⅰ級記1分，26%－75%為Ⅱ級記2分，≥76%為Ⅲ級記3分。每張切片最后的得分為兩次評分的乘積（1－9分），≥3分為陽性，＜3分為陰性。

2．1．2RT－PCR 總 RNA 提?。喝?0－100mg組織勻漿后用Trizol提取液提取總RNA，取部分總RNA用紫外分光光度儀A260／A280，要求全部樣本 OD260／OD280比值在1．8－2．0之間；cDNA 制備：操作過程參考逆轉錄試劑盒說明書進行，總RNA加入量為0．1－5μg，反應終體積20μl；PCR擴增：EZH2 基 因 上 游 引 物 5′－TCATGCAACACCCAACACTTA－3′，下 游 引 物 5′－CACCACTCCACTCCACATTCT－3′；β－actin 上 游 引 物 5′－CTGGGACGACATGGAGAAAA－3′，下 游 引 物 5′－AAGGAAGGCTGGAAGAGCGC－3′，反 應 條 件：95℃預變性5min后，以94℃45s變性，EZH2退火溫度57．1℃，β－actin退火溫度55．6℃，各進行45s，72℃延伸45s，反應35循環(huán)，最后一輪延伸7min。預期擴增產物大小分別為407bp和564bp。

2．1．3PCR產物判定：取5μl擴增產物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳（電壓按100V，電流60mA），溴化乙錠（EB）顯色，結果在GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍攝記錄，并使用圖像分析軟件行灰度掃描作半定量分析，以EZH2的吸光度值與β－actin吸光度值的比作為EZH2的基因表達半定量值。

2．2Hp－L型檢測

革蘭染色檢測Hp－L型感染，油鏡（10×100）觀察并計數(shù)，每例隨機觀察10－15個視野，取平均數(shù)，Hp－L型和Hp平均數(shù)≥20為陽性，＜20或未查見Hp－L型和Hp為陰性，Hp－L型形態(tài)多樣，大小不等，有巨形體、圓球體等。革蘭染色陰性呈紅色，陽性呈紫紅色，Hp－L型大多數(shù)呈革蘭染色陰性（紅色），少數(shù)Hp－L型革蘭染色陽性（紫紅色）；Hp則呈螺旋形、“S”形或海鷗形，革蘭染色陰性（紅色）。革蘭染色L型細菌檢出和免疫組化Hp－L型抗原表達同時陽性者定為Hp－L型感染陽性。每例標本同時用免疫組化法檢測Hp－L型抗原的表達，Hp－L型多克隆抗體由蚌埠醫(yī)學院微生物教研室制備，工作濃度為1∶100。用已知Hp－L型陽性切片作為陽性對照，用PBS替代一抗為陰性對照。Hp－L型免疫組化的陽性標準為：胃癌細胞、正常胃黏膜上皮細胞及間質巨噬細胞的胞質或胞膜著棕黃色為Hp－L型陽性，常呈細顆粒狀，不著色為陰性。革蘭染色Hp－L型檢出和免疫組化Hp－L型抗原表達同時陽性者定為Hp－L型感染陽性。

2．3統(tǒng)計學處理

采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件對相關的數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學處理：計數(shù)等級資料采用t檢驗、χ2檢驗和單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．胃癌的EZH2表達及與臨床病理因素的關系

EZH2蛋白在胃癌中的表達陽性率為62．5%（50／80）；顯著高于對照組（8／30，26．7%），兩者比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01，表1），經(jīng)χ2檢驗，胃癌組織中EZH2的表達與患者的年齡、性別、腫瘤細胞分化程度無關，而與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移和臨床分期相關（均P＜0．05，表2，圖1，2）。

表1 不同組織中EZH2蛋白的表達情況Table 1 The expression of EZH2in different gastric tissues

表2 胃癌組織EZH2蛋白表達與臨床病理學特征的關系Table 2 Relationship between the expression of EZH2and clinical pathological characteristics in gastric carcinom

2．EZH2擴增產物與內參基因電泳結果

胃癌組織和對照組組織中均可在凝膠成像儀下見到擴增的EZH2條帶（407bp處），但腫瘤組織的較對照組組織稍清楚（見圖3），并同時用電泳β－actin內參（564bp處）和DNA標準分子量標記物（DNA Marker）作為參照和標尺。經(jīng)過凝膠成像分析儀掃描后，對30例胃癌患者EZH2／β－actin電泳條帶吸光度比值（mRNA水平相對值一目的條帶吸光度值／內參β－actin條帶吸光度值），進行統(tǒng)計學分析，胃癌組織中EZH2mRNA的表達量為0．9117±0．0765，遠端正常對照組織的表達量0．7535±0．0716，胃癌組織中EZH2mRNA顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。

圖3 EZH2mRNA的瓊脂糖電泳圖（1、3、5為胃癌組，2、4、6為對照組）Fig．3Agarose electrophoresis of EZH2mRNA （1、3、5for the GC group，2、4、6for the controls group）

3．胃癌中Hp和Hp－L型的檢測結果及分布

胃癌組中有63例革蘭染色檢出L型，僅7例同時檢出L型和 Hp，檢出率分別為78．8%（63／80）和8．8%（7／80）。免疫組織化學法 Hp－L型抗原表達陽性見圖5，其陽性率為73．8%（59／80），與革蘭染色L型檢出的陽性率具有一致性（P＞0．05）。80例胃癌組織中Hp－L型陽性（即革蘭染色L型檢出陽性和免疫組化Hp－L型抗原表達同時陽性）的病例數(shù)為57例，其陽性率為71．3%。對照組中有10例革蘭染色同時檢出Hp和L型，免疫組化Hp－L型抗原表達陽性為7例，兩種方法檢測同時陽性（即Hp－L型陽性）的有7例，陽性率為23．3%（7／30），Hp檢出陽性率為30%（9／30），經(jīng)統(tǒng)計學處理與Hp－L型檢出陽性率差異無顯著性（P＞0．05）。從表3可見胃癌組中Hp－L型陽性率（71．3%）高于對照組（23．3%），兩者有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。觀察革蘭染色切片發(fā)現(xiàn)，Hp－L型主要存在于胃癌癌巢和癌旁，癌細胞的胞漿內也可查見，癌巢的壞死處幾乎無Hp－L，正常組織內也較少見。Hp則主要存在于正常組織內，呈螺旋形，“S”形和海鷗形，癌巢、癌旁較少，癌巢的壞死處幾乎無Hp。Hp－L型大部分是革蘭染色陰性，多數(shù)呈圓球形，可在癌巢、癌間質或黏膜層聚集成堆，也可散在分布于其中，也可見到L型黏附于癌細胞表面的現(xiàn)象（圖4）。

4．胃癌中Hp－L型感染與EZH2蛋白表達的關系

從表4可見，胃癌Hp－L型陽性組的EZH2表達明顯高于其Hp－L型陰性組，應用Spearman秩相關檢驗，兩者之間呈正相關（r＝0．250，P＜0．05）。

表3 不同組織中Hp－L檢測情況Table 3 The result of Hp－L detected in different gastric tissues

表4 80例胃癌組織中Hp－L感染與EZH2蛋白表達之間的關系Table 4 The relativity between Helicobacter pylori L－formt infection and he expression of EZH2in80samples of gastric carcinoma

討 論

EZH2作為PcG（polycomb group）基因家族的核心成員，是果蠅zeste基因增強子的人類同源基因。EZH2與細胞生長調節(jié)相關，通過抑制染色質中的靶基因而調節(jié)細胞增殖，作為轉錄阻遏因子，控制細胞的記憶系統(tǒng)。近年研究表明，EZH2基因的過表達與細胞的過度增殖乃至腫瘤發(fā)生有關。Croonquist［3］等報道顯示，在多種實體瘤中存在著過表達并與腫瘤的生物學行為及預后有關，故認為EZH2基因是一個候選的癌基因。EZH2能夠促進細胞增殖、腫瘤細胞擴散，在許多惡性腫瘤中存在不同程度的高表達。包括骨髓腫瘤、非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、大腸癌、肝癌等，并與腫瘤 的 侵 襲 轉 移 和 預 后 有 關［1－2］。 有 研 究 報 道［4－5］EZH2可促進胃癌細胞增殖，可以推測，EZH2參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制之一可能與其促進增殖能力有關，這與惡性腫瘤中的研究結果一致。Chen等［6］研究顯示，EZH2在胃癌組織中的表達可達到56．6%，并且腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴結轉移、侵犯血管致血運轉移及臨床分期都可影響其表達水平。Mccabe等［7］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌有無遠處轉移和EZH2表達水平的高低有關，玄東春［8］等研究顯示，EZH2表達水平與胃癌的進展有關，進展期胃癌組織中EZH2的表達水平明顯高于早期胃癌。本研究采用免疫組化法檢測了80例胃癌組及30例對照組的EZH2蛋白表達情況，應用RT－PCR檢測30例新鮮胃癌組及30例對照組的EZH2mRNA表達，發(fā)現(xiàn)EZH2在胃癌組中表達明顯增高，而且EZH2表達增高與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度和TNM分期有關，與文獻結果基本一致。提示EZH2可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并且對胃癌的預后評估有很大幫助。

幽門螺桿菌（Hp）已被公認為慢性胃炎、消化性潰瘍的致病因素，也與胃癌的發(fā)生密切相關。Hp主要定植于人胃黏膜，在不利于其生長繁殖的環(huán)境中易發(fā)生細胞壁缺陷而形成幽門螺桿菌L型（Hp－L），Hp－L型對環(huán)境抵抗力強，是Hp適應外界不良條件的一種自我保護形式［9，10］，Hp－L型的生物學性狀與原菌相比也有很多相似處，F(xiàn)igueroa等［11］用免疫印跡證明Hp－L型可能與原菌一樣具有免疫功能。進一步研究證明，Hp－L型抗原與原菌相比僅有量的減少，或僅有某些細胞壁抗原成分的缺失而無質的變化，甚至比原菌的致病性要強。Cellini等［12］用 Hp－L 型感染BALB／c小鼠，2周后可見鼠胃內有Hp－L型的定居，1個月后引起胃組織學改變，并使小鼠產生抗Hp的抗體。宣蘭蘭等研究［13］證實Hp－L型可以抑制胃癌細胞的凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)生。周蕾等［14］對120例胃癌進行 Hp－L型檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌組 Hp－L型檢出率（68．33%），結果提示Hp－L型感染是影響胃癌侵襲和轉移的重要因素之一。本研究對80例胃癌、30例切緣對照胃黏膜進行Hp－L檢測，結果有57例胃癌檢出Hp－L，15例同時檢出Hp和L型，僅5例單純Hp檢出陽性，說明Hp在患者體內易發(fā)生L型變異，多數(shù)是以Hp－L型的形式存在。Chan等［15］研究也發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Hp通常以L型的形式存在，且在癌變組織中的檢出量遠高于潰瘍病患者。本研究革蘭染色切片在油鏡下均見到Hp－L型位于胃黏膜的淺表胃小凹內、胃癌腺體內及胃癌細胞內，說明Hp－L型在胃癌的發(fā)生和進展過程中可能以一種播散侵入的方式而定植，這一結果與胃潰瘍中的Hp－L型感染情況相近［17］。

我們對Hp－L型感染和EZH2表達的關系進行研究和分析，發(fā)現(xiàn)Hp－L型陽性組中EZH2表達陽性的例數(shù)較Hp－L型陰性組中EZH2表達陽性的例數(shù)明顯增多，數(shù)據(jù)采用卡方檢驗分析P＜0．05，兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義，說明Hp－L型感染可促進胃癌組織中EZH2的表達，并且是胃癌發(fā)生的一個危險因素。至于EZH2和Hp－L型具體致癌機制及二者之間的相互作用機理有待進一步研究。

圖 版 說 明

圖1 EZH2蛋白在胃腺癌中的表達陽性，主要表達于細胞核（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

圖2 EZH2蛋白在切緣正常組織中的表達陰性，細胞核不著色（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

圖4 正常胃組織內的Hp及Hp－L型（A）及胃腺癌中的Hp－L型（B）。Hp呈螺旋形、“S”形或海鷗形。Hp－L型位于癌細胞內及癌細胞旁，呈圓球狀，有圓球體、巨形體和原生小體等（箭頭）（革蘭氏×1000）

圖5 Hp－L型抗原在胃腺癌中的陽性表達，主要表達于細胞漿（Elivision×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Positive expression of EZH2in the nuclei of adenocarcinoma cancerous tissue（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

Fig．2negative expression of EZH2in the nuclei of normal gastric mucosa tissues（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

Fig．4Hp and Hp－L form in Normal and adenocarcinoma gastric tissue of Hp were spira，“S”－shaped or seagull shape，Hp－L form cylindrical and spherical，the sphere，giant body and native body（arrow）（Gram stain×1000）．

Fig．5Positive expression of Helicobacter pylori L－form in gastric adenocarcinoma（Elivision×400）

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