Ezrin蛋白在眼瞼基底細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其意義

陳志雄 黃 瓊 陳小希

（1武漢大學(xué)人民醫(yī)院老年病科，2眼科，武漢430060；3湖北省地質(zhì)職工醫(yī)院，武漢430072）

眼瞼基底細(xì)胞癌（basal cell carcinoma，BCC），是發(fā)生于眼瞼的最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)生率分別位居第一和第二位。好發(fā)于下瞼及內(nèi)、外眥部［1］?；准?xì)胞癌是低度惡性腫瘤，早期診斷和及時(shí)治療，可保存眼瞼功能和視力，因此應(yīng)力求早期診斷、早期治療。

Ezrin是ERM蛋白家族中研究最多的一個(gè)成員，活化的Ezrin蛋白具有連接細(xì)胞膜與肌動(dòng)蛋白絲，參與控制細(xì)胞的形態(tài)建成、黏附、運(yùn)動(dòng)及為細(xì)胞的增殖和生存轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)信號(hào)等功能［2］。多項(xiàng)研究表明Ezrin的表達(dá)水平與多種腫瘤的侵襲力、轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后有密切關(guān)系［3，4］。

采用免疫組織化學(xué)方法研究Ezrin蛋白在眼瞼基底細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，探討Ezrin蛋白在BCC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中的作用，為治療基底細(xì)胞癌提供理論依據(jù)。

材料和方法

1．材料

1．1標(biāo)本來(lái)源

收集武漢市中心醫(yī)院和武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2002－2009年手術(shù)切除及活檢的眼瞼基底細(xì)胞癌（basalcell carcinoma，BCC）標(biāo)本共20例，另取癌周?chē)＝M織5例作對(duì)照?；准?xì)胞癌發(fā)病年齡20－68歲。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)HE染色，光鏡觀察，病理檢查確診。

1．2主要試劑

（1）濃縮型兔抗人Ezrin蛋白多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）；（2）超敏即用型S－P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物有限公司）；（3）顯色試盒及多聚賴(lài)氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

2．方法

2．1常規(guī)HE染色

取材、固定、脫水、透明、切片和HE染色。

2．2免疫組織化學(xué)S－P法檢測(cè)Ezrin抗原

主要步驟：組織切片5μm，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；3%過(guò)氧化氫，37℃孵育10min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS洗4×5min；p53采用微波抗原修復(fù)（3檔，10min），PBS洗4×5min；正常羊血清37℃孵育10min以減少非特異性反應(yīng)；一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶復(fù)合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；DAB顯色液顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

3．免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

3．1Ezrin蛋白以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞核和胞漿內(nèi)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。

3．2采用HPIAS－2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)Ezrin蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。

（陽(yáng)性面積率＝單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率作單因素方差分析和SNK－q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0．05。

結(jié) 果

1．Ezrin蛋白的表達(dá)

基底細(xì)胞癌組織中可見(jiàn)癌細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有密集分布的棕黃色顆粒，Ezrin蛋白表達(dá)強(qiáng)（圖1）；癌旁組織的細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，Ezrin蛋白表達(dá)弱（圖2）。圖像分析結(jié)果經(jīng)q檢驗(yàn)，眼瞼基底細(xì)胞癌與癌旁組織之間，Ezrin蛋白的平均光密度及陽(yáng)性面積率有顯著性差異（P＜0．05）見(jiàn)表1。

2．Ezrin蛋白表達(dá)與基底細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

基底細(xì)胞癌中Ezrin蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與是否復(fù)發(fā)見(jiàn)表2。

圖1 Ezrin蛋白的表達(dá) 基底細(xì)胞癌組織中可見(jiàn)癌細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有密集分布的棕黃色顆粒，Ezrin蛋白表達(dá)強(qiáng)（SP×200）。圖2Ezrin蛋白的表達(dá) 癌旁組織的細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，Ezrin蛋白表達(dá)弱（SP×200）。Fig．1The expression of Ezrin protein in eyelid basal cell carcinoma．There were plenty of brown particles in the cytoplasm，which showed Ezrin protein expressed strongly．S－P×200Fig．2The expression of Ezrin protein in cancer side tissue．There were few brown particles in the cytoplasm ，which showed Ezrin protein expressed weakly．S－P×200

表1 基底細(xì)胞癌與癌旁組織Ezrin蛋白表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（ˉx±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of Ezrin蛋白in eyelid basal cell carcinoma and cancer side tissue（ˉx±s）

表2 Ezrin蛋白陽(yáng)性表達(dá)與基底細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Ezrin protein positive expression with the relationship of basal cell carcinoma the clinical and pathological features

討 論

眼瞼基底細(xì)胞癌是眼瞼惡性腫瘤中最常見(jiàn)的一種，雖然發(fā)病緩慢。但其生物學(xué)行為仍有自身特點(diǎn)［5－7］。BCC（basal cell carcinoma）一 般 只 局 部 侵襲，很少轉(zhuǎn)移，但若不及時(shí)治療，腫瘤可侵及眼輪匝肌、瞼板和眶骨，并可經(jīng)眼眶向顱內(nèi)侵犯。

Ezrin蛋白（又稱(chēng)為cytovillin、p81或villin－2）是在2004年發(fā)現(xiàn)的一種膜－細(xì)胞骨架連接蛋白，具有維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)、連接黏附分子及調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。大量研究表明Ezrin蛋白作為近年在腫瘤轉(zhuǎn)移研究中的相關(guān)蛋白，在很多腫瘤組織中都有異常表達(dá)，可能與促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［8－10］。

實(shí)驗(yàn)研究表明Ezrin蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究表明Ezrin蛋白參與腫瘤細(xì)胞的遷移、發(fā)展，Ezrin蛋白的活化引起腫瘤細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，獲得耐藥性以及凋亡抵抗［11－13］。

研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中存在Ezrin蛋白的異常表達(dá)，Ezrin蛋白的異常表達(dá)往往與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin表達(dá)增高可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，與腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)［14，15］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：20例眼瞼基底細(xì)胞癌組織中Ezrin蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有顯著性（P＜0．05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ezrin蛋白的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致腫瘤的形成，我們推測(cè)：Ezrin蛋白可能參與眼瞼基底細(xì)胞癌的發(fā)生，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步探討。另外我們經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)：在20例眼瞼基底細(xì)胞癌中，其中8例復(fù)發(fā)，在復(fù)發(fā)的8例中就有6例Ezrin蛋白表達(dá)陽(yáng)性，在復(fù)發(fā)的Bcc組織中，Ezrin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)者，二者差別有顯著性（P＜0．05）。由此可見(jiàn)，Ezrin蛋白的表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)有密切關(guān)系，進(jìn)一步提示：Ezrin蛋白表達(dá)水平是反映腫瘤進(jìn)展程度的一個(gè)重要因素。

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