鯉魚（Cyprinus carpio，Cyprinidae）ants基因及其對鱗片發(fā)育的影響

程安達 蔣麗 張保勇，3 王書 張研 劉永新方平 李恒德 孫效文，5

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院水產(chǎn)生物應(yīng)用基因組研究中心，北京 100141；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3. 大連海洋大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116023；4. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院學(xué)科發(fā)展處，北京 100141；5. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150070）

ants（adenine nucleotide translocators），又稱為ATP/ADP載體，可以調(diào)節(jié)ATP和ADP在線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運，所以在真核細(xì)胞的能量代謝中扮演著重要的角色［1-3］。ants作為線粒體內(nèi)膜的組成部分，是線粒體中最豐富的一類蛋白。在呼吸條件下，線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ATP被轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)來維持細(xì)胞活動，作為交換，線粒體外部的ADP被轉(zhuǎn)運進入線粒體內(nèi)，為在ATP合成酶的作用下ADP轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP提供底物。ants屬于線粒體載體家族（mitochondrial carrier family），這個家族可以進行各種各樣的跨線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運活動［3，4］。

ant家族的蛋白是由核基因編碼的，表達之后定位到線粒體內(nèi)膜中。營自由生活的細(xì)菌缺少與ant相似的分子，所以認(rèn)為ant蛋白是由真核起源的廣泛特異的載體家族進化來的［5］。大多數(shù)真核生物，包括單細(xì)胞真核生物，都具有多個ant基因。例如，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）有3個ant基因（ant1，ant2和ant3）可以編碼蛋白質(zhì)［6］。其中，ant2是最主要的同工型，無論是呼吸過程還是厭氧發(fā)酵過程，都是廣泛表達的［7］。ant1和ant3分別特異的在有氧和厭氧的條件下表達［6，8］。此外，ant2和ant3在丟失線粒體基因組的情況下仍能轉(zhuǎn)運ATP來維持酵母的生存，而ant1則無此功能［9］。因此，不同的ant基因可能是被用來輸入和輸出ATP以有效地應(yīng)對外部的營養(yǎng)和氧氣條件的變化。有趣的是啤酒酵母（S. cerevisiae）的ant1基因具有比ant2和ant3更高的堿基累計替換率［10］，這與ant1基因在復(fù)制之后發(fā)生了功能上的變化的觀點一致。

多細(xì)胞生物體中，在不同類型的組織，不同的發(fā)育時期以及不同的細(xì)胞增殖狀態(tài)下，ant基因的表達都是不同的。大多數(shù)脊椎動物都可以表達3個不同的旁系同源的ant基因，它們表現(xiàn)出較高程度的序列相似性。其中，ant1（Slc25a4）主要在心臟和骨骼肌中表達，可以假定它可以適應(yīng)心臟和骨骼肌中 ATP的快速代謝［11］。ant2（Slc25a5）和ant3（Slc25a6）在軀體組織中廣泛表達，然而，ant2在哺乳動物快速生長的細(xì)胞中表達量較高，是有變化的，而ant3似乎是在所有組織中組成性的表達，其表達量無太多變化［12，13］。嚙齒類動物缺少ant3基因，其ant2基因很可能同時承擔(dān)了人類上ant2和ant3基因的功能［14，15］。在哺乳動物中，還存在第4種ant家族基因ant4（Slc25a31），它是在人和小鼠中首先被發(fā)現(xiàn)的［16-18］。它可以選擇性地在成熟哺乳動物的睪丸和精子中表達，且在小鼠（mouse）精子發(fā)生過程中是必需的，但在鳥類、魚類、蛙中卻是缺少的［19］。ant4可以在成熟小鼠睪丸中的生殖細(xì)胞中特異表達，且在減數(shù)分裂時期，其表達量特別的高［20］。

鱗的形成是個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，可能需要成千上萬的基因參與其中。ant作為ATP/ADP轉(zhuǎn)運載體，可以為各個細(xì)胞的活動運送能量，它在鱗形成過程中可能發(fā)揮必不可少的作用。為了研究鱗形成的分子機制，我們利用Genefishing技術(shù)特異地釣取了鯉皮膚組織中的ant基因，經(jīng)過克隆測序鑒定并進行初步的生物信息學(xué)分析來解析ant基因的基本特征，并通過原位雜交技術(shù)對該基因在鱗被形成過程中的表達進行分析，以此證明ant基因與鱗被發(fā)育的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

用于提取RNA的鯉魚樣品以及用來做原位雜交的幼魚都來自于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實驗基地和無錫淡水研究中心。提取RNA的鯉魚樣品用新鮮的鯉魚皮膚組織，Trizol試劑購自Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡（Toyobo）公司。

1.2 方法

1.2.1 ant基因的釣取 利用Genefishing（Seegene，Korean）試劑盒對全鱗的普通鯉魚建鯉（Common Carp）和普通鯉魚天然選擇突變體德國鏡鯉（Germany Mirror Carp）的皮膚進行總RNA的差異篩選，試驗步驟參照試劑盒的protocol。

1.2.2 ant基因CDS全長的克隆 刮掉鯉魚的鱗片，取100 mg皮膚組織，用Trizol法提取RNA，DEPC水溶解RNA，利用分光光度計測定所提RNA的OD260/OD280值來判斷RNA的質(zhì)量，調(diào)節(jié)RNA的濃度為1 μg/μL，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。按照東洋紡RNA反轉(zhuǎn)試劑盒的說明操作反轉(zhuǎn)RNA為第一鏈cDNA。

根據(jù)斑馬魚ant基因的mRNA序列在5'UTR和3'UTR的保守區(qū)域分別設(shè)計目的片段包含CDS全長的上下游引物（Forward 5'-3'：CATTTCGAATCAGCCGGCATTC Reverse 5'-3'：GAAAACAGGTAGATTTTAGTAC），以反轉(zhuǎn)得到的鯉魚第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物凝膠電泳后利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，與EZ-T Vector連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，對重組質(zhì)粒進行鑒定后，委托美吉公司進行測序。

1.2.3 生物信息分析 將測序獲得的mRNA序列，利用NCBI上的ORF Finder預(yù)測其開放閱讀框，以確定其起始密碼子和終止密碼子位點，從而獲得CDS全長序列。利用MEGA5軟件對測序得到的多條CDS序列進行ClustalW比對。利用MEGA5軟件將CDS序列翻譯成氨基酸序列，對其進行比對。從NCBI網(wǎng)站下載的不同分類地位的其它物種ant基因的氨基酸序列與測序得到的ant氨基酸序列一起利用MEGA5的鄰接法構(gòu)建進化樹進行分析。

1.2.4 原位雜交檢測基因在皮膚中的表達

1.2.4.1 反義RNA探針的制備 利用PrimerPremier5.0軟件在該基因mRNA的特異區(qū)域設(shè)計片段長度為200 bp左右的一對引物（Forward 5'-3'：TGGGTAACTGCTTGGTGAAGATCTCC Reverse 5'-3'：ACCAGCAACAGCAGTCACAGTCTGA），以反轉(zhuǎn)得到的鯉魚第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；66℃退火30 s；72℃延伸15 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，回收產(chǎn)物與EZ-T Vector連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。對重組質(zhì)粒進行測序，鑒定目的片段插入方向。根據(jù)插入方向，對重組質(zhì)粒進行線性化酶切（10 μg），選擇T3或T7啟動子進行體外轉(zhuǎn)錄。若反向插入，用下游NotⅠ酶切位點酶切，用T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄。若正向插入，用上游XhoⅠ酶切位點酶切，用T3啟動子體外轉(zhuǎn)錄。以線性質(zhì)粒為模版，體外合成地高辛標(biāo)記RNA探針。20 μL反應(yīng)體系如下：線性化模版DNA 1 μg，T3或T7 RNA聚合酶1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，DIG-RNA dNTP 2 μL，5×Buffer 4 μL，去 RNase 水補充到 20 μL，37℃水浴2 h，稍離心后加1 μL DNaseⅠ37℃水浴20 min。取0.5 μL，進行電泳鑒定探針是否合成出來。用試劑盒對RNA進行產(chǎn)物純化，純化后的RNA probe 稀釋到HYB+（稀釋濃度，不同基因，所需probe不同。一般是20℃洗脫，1∶100稀釋），用于原位雜交。制備正義RNA探針作為對照，其線性化酶切位點和體外轉(zhuǎn)錄方向的選擇與反義探針的制備正好相反。

1.2.4.2 原位雜交所用魚的飼養(yǎng)和前期處理 孵化黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實驗基地的人工授精的鯉魚卵，開口餌料為草履蟲，逐漸過渡到鹵蟲無節(jié)幼體和鯉魚顆粒飼料喂養(yǎng)幼魚，直到剛開始產(chǎn)生鱗片。收集剛開始產(chǎn)生鱗片的幼魚，置于冰上將其殺死，利用4%的多聚甲醛進行固定，4℃過夜，逐漸過渡到無水甲醇中脫水，在甲醇中-20℃過夜。

1.2.4.3 原位雜交的步驟 原位雜交參照Westerfield［21］和 Jowett［22］所敘述的方法。將幼魚從甲醇中逐漸過渡到PBST（DEPC水配制）溶液中，置換成HYB-溶液65℃水浴30 min，置換成HYB+溶液65℃預(yù)雜交6 h以上。置換成加入探針的HYB+溶液，65℃雜交15 h?；厥仗结?，-70℃保存。在65℃下清洗幼魚，洗去多余的探針，50%甲酰胺/2× SSCT 2次，每次1 h，2 X SSCT 1次，15 min，0.2 ×SSCT洗2次，每次1 h。室溫下，用MABT洗3次，每次10 min，加入封閉液室溫緩慢搖動封閉2 h。更換新鮮的封閉液，按1∶3 000比例加入耦聯(lián)堿性磷酸酶的抗地高辛抗體（Anti-digoxigenin-AP Fab fragments），4℃緩慢搖動過夜。半對照不加入探針，但加入抗體，空白對照不加抗體。用含10%滅活羊血清的MABT緩慢搖動50 min，用MABT清洗3次，每次時間為2 h。用染色緩沖液（Staining buffer）平衡3次，每次10 min。加入含5 mmol/L左旋咪唑的顯色液BM Purple AP Substrate，避光室溫顯色。根據(jù)具體情況，每隔一段時間觀察幼魚皮膚的顯色情況。待顯色完全后，用PBST洗3次，每次10 min，再用4%的多聚甲醛進行固定20 min。用PBST洗去多聚甲醛后置換成90%的甘油進行拍照，4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 Genefishing技術(shù)釣取鱗片發(fā)育相關(guān)基因

利用Genefishing試劑盒中的20對引物對兩組鯉魚樣品進行差異篩選，得到表達差異的片段后進行克隆測序。如圖1所示，總共得到了7個差異產(chǎn)物（展示部分圖）。用試劑盒中所帶的簡并引物ACP28在德國鏡鯉中擴增出了一個約500 bp的特異條帶，但同時在建鯉中是沒有表達的；利用ACP29在鏡鯉中擴增出了一個差異于建鯉的約700 bp的條帶（其他未展示的幾組引物篩選出來的差異表達產(chǎn)物在此不作介紹）。經(jīng)過克隆測序鑒定，其中ACP28擴增出的產(chǎn)物是ant基因表達產(chǎn)物。

2.2 ant基因全長CDS的克隆和序列分析

圖1 Genefishing篩選建鯉和鏡鯉的皮膚總RNA的反轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA

提取鯉魚皮膚組織的RNA，利用東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)合成第一鏈cDNA，以cDNA為模板，利用包含基因CDS全長的引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、克隆培養(yǎng)、挑取多個克隆測序，經(jīng)ClustalW比對得到6條不同的CDS全長序列，分別表示為 CDS1、CDS2、CDS3、CDS4、CDS5和CDS6（圖2）。利用NCBI上的ORF Finder預(yù)測其開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)ants基因CDS全長897 bp，可編碼298個氨基酸。利用MEGA5軟件將CDS序列翻譯成氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)有4條不同氨基酸序列，分別為a、b、c和d，其中CDS1、CDS5和CDS6編碼相同的氨基酸序列a，而CDS2、CDS3和CDS4分別編碼序列b、c和d。它們是高度保守的，但是仍存在部分差異（圖3），兩兩相似性達到98%-99%，這些高度保守的相似性很高的類似蛋白很可能是由同一個基因同源分化來的，需要對其進行進一步的研究。物種間構(gòu)建進化樹進行分析，發(fā)現(xiàn)鯉皮膚中ant基因的氨基酸序列與斑馬魚ant2最為接近，說明由鯉魚皮膚中釣取的ant基因是ant2的可能性較大。由圖4聚類的結(jié)果（方框部分）可以看出，哺乳動物中的人（human），牛（bovine），小鼠（mouse）和大鼠（rat）的ant2親源關(guān)系比較近，而與魚類中的河豚（fugu），斑馬魚（zebrafish）和鯉相距較遠(yuǎn)，這也是符合進化關(guān)系的。

2.3 ant基因在皮膚中的表達

利用整體原位雜交的方法，制備地高辛標(biāo)記的反義RNA探針，與皮膚中的mRNA進行特異雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ant基因在即將產(chǎn)生鱗片的皮膚處特異表達（圖5 -H），表明ant基因參與到鱗的形成過程中。ant基因在鯉正在產(chǎn)生鱗片的皮膚處表達明顯增強（圖5 -H），而在皮膚的其它部位則表達較弱或不表達，正義探針作為負(fù)對照中沒有雜交信號（圖5- I），這個結(jié)果表明ant2基因可能在鱗片發(fā)生及其維持過程有重要作用，這與ant2在哺乳動物快速生長的細(xì)胞中表達量較高，且有變化的［12，13］觀點一致。ant是一種線粒體中含量十分豐富的能量轉(zhuǎn)運載體蛋白，它可以將線粒體產(chǎn)生的ATP運出，為細(xì)胞的生命活動提供能量。由此可以推測，ant基因在鱗片部位的表達可能是與鱗被形成過程中，產(chǎn)生鱗片的細(xì)胞或者維持鱗片發(fā)育的皮膚細(xì)胞由于其生理活動的加強而需要更多的能量有關(guān)，從而需要較多的能量載體蛋白，而這種轉(zhuǎn)運蛋白本身具有特異性。

圖2 建鯉皮膚中釣取的6條不同的ants基因CDS全長序列

圖3 建鯉皮膚中釣取的4條不同的ants基因氨基酸序列

圖4 建鯉中釣取的4條氨基酸序列與其它物種ants序列構(gòu)建進化樹

圖5 原位雜交檢測ANTs基因在不同時期胚胎和幼魚皮膚中的表達

在我們的研究中，利用Genefishing技術(shù)采用多對特異的簡并引物對一組有鱗和散鱗的樣品進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差異篩選，用40對引物（該文中未展示）共得到了40個差異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，我們將對其逐一進行功能解析，本研究中為ant基因。為了驗證Genefishing的效率，把篩選出來的差異表達基因返回到德國鏡鯉和建鯉中進行RT-PCR驗證（圖6），證明陽性率可達90%（40/44）。因此Genefishing篩選差異基因具有陽性率高，篩選效率高的特點。

3 討論

圖6 RT-PCR驗證差異產(chǎn)物在德國鏡鯉和建鯉中的表達情況

鱗片作為皮膚重要的附屬物，與哺乳動物的毛發(fā)、指甲等一樣，是由皮膚原始干細(xì)胞經(jīng)過定向分化而來，具有重要的生物學(xué)意義。魚類的鱗片除了減少游動產(chǎn)生的摩擦力、維持體型骨架的基本功能之外，同時還具有很重要的防御病原菌侵害的功能。根據(jù)鱗片的形態(tài)不同，可以將魚類的鱗片分為楯鱗，硬鱗和骨鱗，其中骨鱗又分為圓鱗和櫛鱗，這些形態(tài)各異的鱗片的發(fā)育都是有其固定的模式，這就是我們所說的鱗片的模式形成和形態(tài)建成。鱗片發(fā)生及發(fā)育的分子機制一直以來是水產(chǎn)生物學(xué)家非常感興趣的生物學(xué)問題，但由于魚類的研究囿于其基因組相對龐大，基因組成比較復(fù)雜，進化上較為古老等原因一直比較落后。迄今為止，已經(jīng)克隆并且證實與魚類的鱗片發(fā)生及發(fā)育相關(guān)的基因比較有代表性的有 fgf/fgfr［21］，apoE［22］，EDA/EDAR［23，24］，SHH［25，26］等，而且他們利用的是傳統(tǒng)的分子遺傳學(xué)方式篩選出了鱗片發(fā)育紊亂的突變體，該種方法準(zhǔn)確但是通量較低，而且由于魚類多倍體的特征，使得突變表型由于冗余或者相同基因功能的互補而不能快速地定位鱗被相關(guān)基因。目前得益于測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展尤為迅速而且價格低廉，我們可以從轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)物為突破口，高通量、快速地挖掘鱗被相關(guān)因子，然后進行功能研究，不失為一種高效的策略。

我們特異地從皮膚中釣取ant基因，進行多次測序，最終得到了4條不同的氨基酸序列，它們氨基酸差別不大，有的甚至只相差一個氨基酸。經(jīng)簡單的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們與斑馬魚ant2基因的相似性最高，猜測它們很可能同屬于ant2，它們之間的不同可能是由堿基突變或SNP造成的。由進化樹可以看出哺乳動物以及鳥類等高等脊椎動物的ant基因歸類明顯，而魚類與其相比，顯得有些混亂，盡管如此，可以明顯地發(fā)現(xiàn)鯉皮膚中釣出的ant基因明顯的與斑馬魚ant2基因歸在一起，所以是ant2的可能性最大。

釣取皮膚中的ant基因，雖然得到4條不同的氨基酸序列，但是它們的相似度極其的高，很可能都屬于ant基因。在哺乳動物中ant3基因廣泛表達。由此推知ant3在鯉魚的皮膚中很可能也是表達的。但是卻沒有被釣出，一方面可能是由于挑取測序的克隆較少，沒有達到飽和，所以漏掉了某些ant基因；另一方面可能是ant3確實不在皮膚處表達，則說明鯉魚與哺乳動物中的ant基因特化的程度差別很大。斑馬魚是二倍體魚類，而鯉魚是經(jīng)過了四倍體的二倍體化的過程，鯉魚的染色體數(shù)是斑馬魚的兩倍。目前斑馬魚已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有3個ant基因，分別是ant1、ant2和ant3。由此推測，若是將鯉魚中的ant基因全部找出，很可能是6條或者是更多。

經(jīng)整體原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)ant基因確實在正要產(chǎn)生鱗片的皮膚處高表達，而在其它部位則表達較弱或不表達，說明ant基因確實是在鱗形成的過程中發(fā)揮了一定的作用。由于ant基因序列的相似度太高，無法用原雜的方法區(qū)分參與到鱗形成過程的是ant基因的哪一個同工型；但是，通過原雜發(fā)現(xiàn)在皮膚中ant基因的表達有強弱變化。在形成鱗的部位ant的表達量要明顯高于還未生長鱗的部位，這與ant2的特點相符。ant2在哺乳動物快速生長的細(xì)胞中表達量較高，且有變化，而ant3似乎是在所有組織中結(jié)構(gòu)性的表達，其表達量無太多變化［12，13］，所以，參與到鱗形成過程中的ant基因很可能是ant2。在鱗形成過程中，細(xì)胞生長增殖等生命活動較旺盛，需要更多的能量供應(yīng)，也就需要表達更多的ant基因來提供足夠的ATP/ADP轉(zhuǎn)運載體。另外，ant2除了在鱗片著生部位強烈特異表達之外，在受精后10 h的外包處開始強烈特異表達，以后的表達逐漸減弱至無，而后又在受精后48 h的體節(jié)中特異超強表達，這些結(jié)果說明ant2在體節(jié)發(fā)育中的功能是通過其精確受控的時空表達而實現(xiàn)的。

4 結(jié)論

ants基因在建鯉（全身被鱗）和德國鏡鯉（部分被鱗）兩種魚的皮膚處表達存在顯著差異，說明ants基因很可能與鱗被的形成發(fā)育相關(guān)。

利用RT-PCR技術(shù)對其皮膚中的ants進行釣取，得到6條不同的ants的CDS序列，分別編碼4條不同的蛋白產(chǎn)物。4個ants表達產(chǎn)物與斑馬魚ant2基因最為相似，且明顯聚類為ant2，說明皮膚中表達的這些ants很可能是ant2。

ant2在受精后4.5 h和6 h不表達，從受精后10 h開始在外包處強烈特異表達，在受精后12 h的胚胎中很弱表達，在受精后24 h的體節(jié)中特異強烈表達，在受精后48 h胚胎無表達，但是在著生鱗片的部位特異強烈表達，而在皮膚的其它部位則表達較弱或者不表達。說明ant2基因確實與鱗被的形成和發(fā)育有關(guān)。

以上的結(jié)果表明，ant2基因可能是通過不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（isoforms）在精細(xì)調(diào)控鱗片的發(fā)育。

致謝：本研究所用試驗材料得到無錫淡水研究中心俞菊華研究員、黑龍江水產(chǎn)研究所張曉鋒和曹頂臣副研究員的幫助，原位雜交實驗技術(shù)受到中國科學(xué)院動物所王強研究員的幫助，在此一并表示感謝。

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