酸堿結(jié)合預(yù)處理對水稻秸稈纖維素乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

段曉健，居學(xué)海，張長波，王景安，劉仲齊

（1.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津300192）

木質(zhì)纖維素是世界上唯一可再生且含量豐富的可利用資源［1］，由木質(zhì)纖維素制得的乙醇因其對環(huán)境的有益影響，作為石油等燃料的替代能源越來越受到關(guān)注［2］。由木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇需要將其中的纖維素轉(zhuǎn)化為易被水解的單糖。研究表明，木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素含量及晶體結(jié)構(gòu)是影響生物質(zhì)原料水解的關(guān)鍵因子，已有多種物理、生物及化學(xué)方法可以提高水解效率［3］。其中物理法能耗高，生物法時(shí)間長且效率低，而化學(xué)預(yù)處理方法主要是采用稀酸、稀堿、有機(jī)溶劑等方法進(jìn)行處理，使用廣泛，在低能耗條件下的木質(zhì)素去除中發(fā)揮了重要作用。NaOH［4－6］、H2O2［7］等小分子物質(zhì)在常溫常壓下能夠有效去除木質(zhì)素，稀酸［7－12］能有效地去除半纖維素，從而提高纖維素和酶的比表面積和降解效率。酸堿結(jié)合處理往往比單一處理更有效，如乙酸－過氧化氫（PAA）預(yù)處理是一種低能耗、有效氧化木質(zhì)素的方法，而堿的使用可以大幅減少預(yù)處理過程中PAA的用量［8］，因此，將氫氧化鈉與PAA結(jié)合能大幅提高甘蔗渣的還原糖產(chǎn)率和乙醇轉(zhuǎn)化率［9］。

水稻秸稈資源極其豐富，年產(chǎn)量達(dá)到650×106～975×106t，且其木質(zhì)素含量低（5%～15%），是產(chǎn)乙醇的優(yōu)良原料。但水稻秸稈的纖維素部分由于木質(zhì)素與纖維素、半纖維素間固有的復(fù)雜結(jié)構(gòu)而難以被酶水解，如何有效去除木質(zhì)素仍然是水稻秸稈發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中的難題。

作者以水稻秸稈為原料，對6種不同的化學(xué)預(yù)處理方法在溫和條件下的木質(zhì)素去除效果以及纖維素乙醇轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了比較，擬為探索低成本的木質(zhì)素去除方法提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

水稻秸稈，自然風(fēng)干后用實(shí)驗(yàn)粉碎機(jī)粉碎后過篩，取20～40目，備用。水稻的木質(zhì)纖維素構(gòu)成：半纖維素24.09%，纖維素35.89%，木質(zhì)素5.28%。

纖維素酶（原產(chǎn)日本，酶活為10 000U·g－1），北京鼎國公司；酵母，安琪酵母公司；衍生化試劑，色譜純，Sigma公司。所用試劑均為分析純。

萬能粉碎機(jī)，控溫?fù)u床，水浴鍋，Agilent GC－MS聯(lián)用儀。

1.2 方法

1.2.1 水稻秸稈預(yù)處理

1.2.1.1 1%乙酸處理

將水稻秸稈與體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸以質(zhì)量體積比1∶100（g∶mL，下同）浸泡2h后，在－20℃處理2 h，然后室溫融化1h。水洗至pH值為中性，去除多余水分，重復(fù)3次，獲得殘?jiān)鼧悠?，烘干稱重后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 5%過氧化氫處理

將水稻秸稈與體積分?jǐn)?shù)為5%的過氧化氫以質(zhì)量體積比1∶100室溫浸泡24h。水洗至pH值為中性，去除多余水分，重復(fù)3次，獲得殘?jiān)鼧悠?，烘干稱重后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 15%PAA處理

PAA的配制：取1.5BV的乙酸，加1BV的30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）過氧化氫，加入1.5%硫酸作為催化劑，在室溫下放置72h。

將30g水稻秸稈與PAA以質(zhì)量體積比1∶10室溫浸泡24h后，在75℃的水浴鍋中保溫3h。水洗至pH值為7.0，重復(fù)3次，獲得殘?jiān)鼧悠?，烘干稱重后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 氫氧化鈉－PAA處理

（1）將水稻秸稈與10%氫氧化鈉按質(zhì)量體積比1∶100分別于室溫浸泡24h和48h。水洗至pH值為中性，去除多余水分至含水量約70%，按質(zhì)量體積比1∶1加入15%PAA，在75℃的水浴鍋中保溫3h，水洗至pH值為7.0，重復(fù)3次，獲得殘?jiān)鼧悠?，烘干稱重后保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）將水稻秸稈與5%氫氧化鈉按質(zhì)量體積比為1∶3在90℃水浴鍋中保溫1.5h。水洗至pH值為7.0，去除多余水分后，按質(zhì)量體積比1∶1加入15%PAA，在75℃的水浴鍋中保溫3h，水洗至pH值為7.0，重復(fù)3次，獲得殘?jiān)鼧悠?，烘干稱重后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水稻秸稈的異步發(fā)酵

在100mL錐形瓶中加入1g預(yù)處理過的水稻秸稈，以pH值4.8的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液作為異步發(fā)酵體系（固液比為1∶20），分別加入350U的纖維素酶，在210r·min－1、50℃的條件下酶解，每隔2h取樣測定葡萄糖濃度。72h后，向其中加入已活化的酵母2mL，24h后取樣測定乙醇體積分?jǐn)?shù)。以未處理的水稻秸稈作為對照。

1.2.3 分析與檢測

葡萄糖濃度采用GC－MS方法測定。

乙醇體積分?jǐn)?shù)采用GC方法測定。

葡萄糖產(chǎn)量和固體得率按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 不同預(yù)處理方法的固體得率和葡萄糖產(chǎn)量

表1 不同預(yù)處理方法的固體得率和葡萄糖產(chǎn)量Tab.1 The solid yield and glucose production for different pretreatment methods

固體得率在一定程度上可以反映木質(zhì)素的去除率，一般和木質(zhì)素的去除率呈負(fù)相關(guān)［10］。由表1可知，1%乙酸和5%過氧化氫預(yù)處理的固體得率都大于70%，其葡萄糖產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它預(yù)處理方法，表明固體得率高的預(yù)處理方法不能有效地去除木質(zhì)素，部分纖維素仍然被木質(zhì)素纏繞，不能被酶充分水解；10%氫氧化鈉－PAA浸泡處理的固體得率最低，約為21%，但其葡萄糖產(chǎn)量也并沒有顯著高于固體得率在40%～50%間的兩個(gè)處理，這說明固體得率較低的預(yù)處理方法可能使纖維素被部分溶解掉，導(dǎo)致葡萄糖產(chǎn)量較低，這和柳枝稷上的研究結(jié)果一致［11］。由此可見，預(yù)處理過程中的固體得率可以較好地反映預(yù)處理的效果，但固體得率過低也會(huì)影響葡萄糖產(chǎn)量，因此，致力于研究既能有效去除木質(zhì)素又不損失纖維素的化學(xué)預(yù)處理方法更有現(xiàn)實(shí)意義。

2.2 乙酸與過氧化氫預(yù)處理效果的比較（圖1）

由圖1可知，經(jīng)1%乙酸、5%過氧化氫預(yù)處理過的水稻秸稈和未處理的水稻秸稈，在纖維素酶作用的最初階段，其葡萄糖濃度均呈指數(shù)升高，在36h時(shí)達(dá)到峰值。反應(yīng)體系中的葡萄糖濃度在處理和對照之間沒有顯著差異，說明這兩種預(yù)處理方法不能有效地破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)。這和已報(bào)道的水稻秸稈用乙酸冷凍處理［12］、甘蔗渣［7］和竹竿［5］用過氧化氫常溫處理的結(jié)果有所不同，說明預(yù)處理的效果和所選擇的生物質(zhì)材料的類型及木質(zhì)纖維素的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有很大關(guān)系［13］。

圖1 乙酸及過氧化氫預(yù)處理對葡萄糖濃度的影響Fig.1 The effect of pretreatment with acetic acid and hydrogen peroxide on the concentration of glucose

2.3 氫氧化鈉－PAA與PAA預(yù)處理效果的比較（圖2）

圖2 氫氧化鈉－PAA與PAA預(yù)處理對葡萄糖濃度的影響Fig.2 The effect of pretreatment with sodium hydroxide－PAA and PAA on the concentration of glucose

由圖2可知，酶解4h左右，預(yù)處理的水稻秸稈和未經(jīng)處理的水稻秸稈的葡萄糖濃度基本相等，在12h前都呈指數(shù)升高；隨著酶解時(shí)間的延長，12h后，經(jīng)氫氧化鈉－PAA和PAA預(yù)處理過的水稻秸稈的葡萄糖濃度迅速上升，遠(yuǎn)高于對照，一直持續(xù)到24h后，纖維素水解速度才開始減慢，且不同處理間葡萄糖濃度的差異越來越明顯。說明不管PAA單獨(dú)作用還是和NaOH共同作用，酸和堿都破壞了水稻秸稈木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)。堿可以潤脹纖維素，乙酸可以溶解半纖維素、氧化木質(zhì)素，都不同程度地使木質(zhì)素得到了氧化，減弱了它們之間結(jié)合的作用力，增大了纖維素酶和纖維素的作用面積。4種方法SPAA－48、SPAA－24、SPAA、PAA的木質(zhì)素去除率分別為79%、78%、59%、50%，水解72h后的葡萄糖濃度分別約為17 mg·mL－1、13mg·mL－1、18mg·mL－1和14mg·mL－1。其中最佳的預(yù)處理方法為SPAA，這種方法不僅對甘蔗渣有良好的木質(zhì)素去除效果［9］，而且對水稻秸稈也具有良好的木質(zhì)素去除效果，并能顯著提高纖維素水解率和乙醇轉(zhuǎn)化率。研究還發(fā)現(xiàn)，用10%氫氧化鈉－PAA在室溫下浸泡48h與用5%氫氧化鈉－PAA 90℃處理1.5h具有同樣的效果，浸泡24h的處理效果較浸泡48h的處理效果差，說明延長室溫浸泡時(shí)間有利于氫氧化鈉－PAA作用于木質(zhì)素，更有效地潤脹纖維，從而提高水稻秸稈酶解的葡萄糖濃度，也說明木質(zhì)素的去除過程可以在更溫和的條件下進(jìn)行。

本研究采用的溫和處理?xiàng)l件，和以往的高溫、高壓處理方法相比，更利于節(jié)約資源。

2.4 不同預(yù)處理方法的乙醇得率

乙醇得率（本研究以乙醇體積分?jǐn)?shù)表示）和預(yù)處理方法有直接的關(guān)系，也和葡萄糖濃度密切相關(guān)。不同預(yù)處理方法的乙醇得率見表2。

表2 不同預(yù)處理方法的乙醇得率Tab.2 The ethanol yield for different pretreatment methods

由表2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和葡萄糖濃度密切相關(guān)，它們之間的線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平（R＝0.987）。說明提高乙醇得率的關(guān)鍵在于提高葡萄糖濃度，但也和選擇的預(yù)處理方法有一定的聯(lián)系，如經(jīng)15%PAA處理的葡萄糖濃度為14.059mg·mL－1，高于SPAA－24處理的葡萄糖濃度12.558mg·mL－1，但其乙醇得率差異不顯著（P＞0.05）；SPAA－48處理的葡萄糖濃度和SPAA處理的葡萄糖濃度差異不顯著（P＞0.05），但其乙醇體積分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05），說明乙醇得率和預(yù)處理方法的選擇也有一定關(guān)系，如過長的預(yù)處理時(shí)間會(huì)使糖變?yōu)樘侨┗蚪到?，?dǎo)致乙醇得率下降［14］。SPAA預(yù)處理效果最好，乙醇得率最高，表明酸堿結(jié)合處理能有效去除水稻秸稈中的木質(zhì)素，大幅提高纖維素水解率和乙醇轉(zhuǎn)化率。由表2還可知，1%乙酸和5%過氧化氫處理的葡萄糖濃度和乙醇得率均低于對照。有研究表明稀酸可以通過溶解半纖維素和潤脹纖維素的結(jié)構(gòu)來提高纖維素酶的酶解效率，但其更適于硬木種類，對軟木種類效果較差［15］。本實(shí)驗(yàn)表明，稀酸對禾本科植物水稻秸稈的作用也甚微，對水稻秸稈木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)沒有影響。

3 結(jié)論

采用6種不同的化學(xué)預(yù)處理方法對水稻秸稈進(jìn)行預(yù)處理脫除木質(zhì)素。結(jié)果表明，稀酸及弱堿即1%的乙酸和5%的過氧化氫對水稻秸稈的木質(zhì)素去除效果不明顯，不能有效地提高葡萄糖濃度；而氫氧化鈉－PAA的復(fù)合去除作用良好，顯著提高了葡萄糖濃度和乙醇得率；用氫氧化鈉－PAA室溫浸泡處理水稻秸稈可以替代氫氧化鈉－PAA高溫處理水稻秸稈，兩者都可以較好地去除木質(zhì)素，同時(shí)潤脹纖維，提高纖維素酶的作用面積；乙醇得率和葡萄糖濃度呈正相關(guān)，但也和預(yù)處理方法有一定聯(lián)系。

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