正交優(yōu)選超聲波輔助提取三明藥用植物金線蓮中總氨基酸的工藝研究

張茶妹，周文富

（三明學(xué)院化學(xué)與生物工程系，福建 三明365004）

金線蓮又名金線蘭、樹(shù)草蓮、金線虎頭蕉、金線入骨消，屬于蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生矮小草本植物［1］，是我國(guó)民間珍稀藥材，其藥用成分倍受人們青睞［2－5］。但由于自然環(huán)境的惡化，野生金線蓮銳減，其有效成分的高效提取成為近年研究的熱點(diǎn)［6－15］。

氨基酸類(lèi)化合物廣泛存在于動(dòng)植物體中，是構(gòu)成植物蛋白的基本物質(zhì)單元。分析植物中氨基酸含量對(duì)研究植物中氨基酸、蛋白質(zhì)的代謝和干旱、鹽分、病菌對(duì)植物的影響以及植物的食用、藥用價(jià)值都具有十分重要的意義［16－18］。已有文獻(xiàn)報(bào)道金線蓮中的微量元素、總氨基酸以及8種人體必需氨基酸的含量均高于國(guó)產(chǎn)西洋參和野生參［19－21］。作者在此采用超聲波輔助提取工藝對(duì)三明藥用植物金線蓮中總氨基酸進(jìn)行提取分離，運(yùn)用茚三酮顯色法和分光光度法對(duì)金線蓮樣品進(jìn)行含量測(cè)定［22］，在通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化金線蓮中總氨基酸提取工藝的基礎(chǔ)上，采用HPLC法測(cè)定了金線蓮中總氨基酸的組成，擬為高效提取金線蓮中總氨基酸提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

金線蓮，由三明生物科技有限公司提供。

L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京天宇祥瑞科技有限公司；無(wú)水乙醇、95%乙醇、石油醚、2%茚三酮溶液、磷酸鹽緩沖溶液（pH＝6.70），分析純；異硫氰酸苯酯、三乙胺，化學(xué)純；甲醇、乙腈，色譜純；超純水。

YF系列高速中藥粉粹機(jī)，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；DHG－9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)箱，上?；|實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；KQ－300DB型超聲反應(yīng)器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB23型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；RE－52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博經(jīng)經(jīng)貿(mào)公司；UV－1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利儀器有限公司；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；1200型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 金線蓮中總氨基酸的提取

將金線蓮置于80℃烘箱干燥6h，粉碎，過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00g金線蓮粉末于三角錐瓶中，按一定比例加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，搖勻，將瓶口用保鮮膜覆蓋，浸泡1h后，置超聲波提取器中提取。冷卻至室溫，抽濾，將濾液移至梨形分液漏斗中加石油醚除去脂溶性物質(zhì)。再移至100mL容量瓶中，定容，搖勻，作為樣品溶液，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和最大吸收波長(zhǎng)的確定［16，17］

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于100℃下干燥至恒重，精密稱(chēng)取10.2mg置于容量瓶中，加入10mL 0.02mol·L－1的氫氧化鈉，全溶后加蒸餾水定容至刻度，得到濃度為0.1mg·mL－1的L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

最大吸收波長(zhǎng)的確定：分別準(zhǔn)確吸取L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液各1.0mL置于25mL容量瓶中，加入2%茚三酮溶液1mL和磷酸鹽緩沖溶液（pH＝6.70）2mL，搖勻，置于水浴鍋中加熱15min后取出，迅速用冷水冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，顯色（氨基酸的顯色反應(yīng)在沸水浴中進(jìn)行，一般水浴溫度控制在90～100℃）。以不加樣品溶液、不加L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、只加顯色劑溶液作空白對(duì)照。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于500～700nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液在566nm處均有最大吸收峰。因此，確定本實(shí)驗(yàn)的最大吸收波長(zhǎng)為566 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程的建立

準(zhǔn)確吸取L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于25mL容量瓶中，于566nm處測(cè)定吸光度。以L－酪氨酸濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L－酪氨酸在2～10μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，擬合線性回歸方程為y＝0.0344x－0.0676，R＝0.9998。

1.2.4 金線蓮中總氨基酸提取率的測(cè)定

精密吸取樣品溶液1.0mL，置于50mL容量瓶中，按1.2.2方法顯色并測(cè)定吸光度。依下式計(jì)算金線蓮中總氨基酸的提取率（M）：

式中：c為樣品中氨基酸的質(zhì)量濃度，μg·mL－1；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.5 金線蓮中總氨基酸的組成分析

樣品的處理：參照文獻(xiàn)［23］進(jìn)行。

衍生化反應(yīng)：精密量取樣品溶液1mL，置于5mL離心管中，干燥。加入乙醇－水－三乙胺（2∶2∶1）溶液1mL、異硫氰酸苯酯－甲醇－三乙胺－水（1∶7∶1∶1）衍生劑溶液2mL，超聲處理后靜置20min，干燥。再加入10mL樣品稀釋液，超聲溶解，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，備用（密閉4℃）。

色譜條件［23］：色譜柱采用Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C為0.1mol·L－1乙酸鈉溶液（冰醋酸調(diào)pH值為6.5）；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫36℃；進(jìn)樣量10μL；流速1.0mL·min－1；按表1進(jìn)行梯度洗脫，洗脫總時(shí)間為21min。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度／%Tab.1 Mobile phase gradient elution／%

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶40（g∶mL，下同）、超聲波功率為60W、提取溫度為60℃、超聲提取2次、每次40min。

2.1.1 提取溫度的影響（圖1）

圖1 提取溫度對(duì)金線蓮中總氨基酸提取率的影響Fig.1 The effect of extraction temperature on extraction rate of total amino acids fromAnoectochilus roxburghii

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，金線蓮中總氨基酸提取率先升高后降低，在提取溫度為60℃時(shí)，提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)?，溫度?huì)影響分子運(yùn)動(dòng)的劇烈程度，蛋白質(zhì)水解、肽鍵斷裂都需要能量，溫度越高，水解越徹底，氨基酸從金線蓮中溶出的量就越多；但溫度過(guò)高時(shí)乙醇的揮發(fā)速度加快、濃度降低，從而影響了氨基酸的溶出，且隨著溫度的升高雜質(zhì)溶出量也會(huì)增加。綜合考慮，選擇提取溫度為60℃左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響（圖2）

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，金線蓮中總氨基酸提取率先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)?，乙醇體積分?jǐn)?shù)偏低時(shí)，金線蓮中極性小的氨基酸溶出量少；而乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，又會(huì)降低極性氨基酸的溶出量，使植物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)很快凝結(jié)，從而阻礙乙醇向植物細(xì)胞內(nèi)滲透，進(jìn)一步影響氨基酸的浸出，同時(shí)，使提取液中帶入色素和脂溶性物質(zhì)的量增加，導(dǎo)致總氨基酸提取率降低。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%或更低時(shí)，提取液變得粘稠，難以過(guò)濾，可能是金線蓮中多糖類(lèi)成分溶出所致。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金線蓮中總氨基酸提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total amino acids fromAnoectochilus roxburghii

2.1.3 料液比的影響（圖3）

圖3 料液比對(duì)金線蓮中總氨基酸提取率的影響Fig.3 The effect of solid－liquid ratio on extraction rate of total amino acids fromAnoectochilus roxburghii

由圖3可知，金線蓮中總氨基酸提取率隨溶劑量的增加而升高，在料液比達(dá)到1∶40時(shí)，提取率基本趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，?dāng)溶劑量過(guò)少時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)的氨基酸易與溶液中的氨基酸達(dá)到濃度動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致總氨基酸提取率下降；而溶劑量過(guò)多時(shí)，氨基酸的溶出量降低，提取率升幅不明顯。因此，選擇料液比為1∶40左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間的影響（圖4）

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，金線蓮中總氨基酸提取率先升高后降低，在提取時(shí)間為40min時(shí)，提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)椋虝r(shí)間的超聲處理對(duì)細(xì)胞的破壞作用較大，總氨基酸的溶出量較多，提取率上升較快；但長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用會(huì)使植物組織中大量的細(xì)胞破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量的不溶物及較多的粘液質(zhì)等溶出，使溶液中的雜質(zhì)增多，傳質(zhì)阻力增大，影響了氨基酸的溶出，并且長(zhǎng)時(shí)間處于較高的溫度下，乙醇的揮發(fā)量增多，氨基酸的氧化分解也會(huì)加劇。因此，選擇提取時(shí)間為40min左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)金線蓮中總氨基酸提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on extraction rate of total amino acids fromAnoectochilus roxburghii

2.1.5 超聲波功率的影響（圖5）

圖5 超聲波功率對(duì)金線蓮中總氨基酸提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on extraction rate of total amino acids fromAnoectochilus roxburghii

由圖5可知，金線蓮中總氨基酸提取率隨著超聲波功率的增大逐漸升高，當(dāng)超聲波功率大于60W后，提取率基本趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，隨著超聲波功率的增大，分子運(yùn)動(dòng)加快，對(duì)細(xì)胞的破壞程度也加大，氨基酸的溶出量增多。因此，選擇超聲波功率為60W左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、超聲波功率為考察因素，以總氨基酸提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

由表2可知，各因素對(duì)金線蓮中總氨基酸提取率的影響大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞超聲波功率，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40、超聲波功率60W、提取2次、每次提取40min。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照篩選出的優(yōu)化工藝進(jìn)行了3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，總氨基酸提取率分別為9.86%、9.82%、9.89%，平均達(dá)到9.86%，高于正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從而證明所確定的最佳提取條件是合理、穩(wěn)定的。

2.4 金線蓮中總氨基酸組成的HPLC分析（圖6）

圖6 金線蓮中總氨基酸的高效液相色譜Fig.6 HPLC Chromatogram of total amino acids fromAnoectochilus roxburghii

由圖6可知，金線蓮中每種氨基酸都可以正常出峰，分離效果良好，且各個(gè)峰的保留時(shí)間與文獻(xiàn)［24］對(duì)照品溶液基本一致。根據(jù)HPLC色譜及各種氨基酸的極性分析，三明產(chǎn)金線蓮含有16種可檢出的氨基酸，其中非必需氨基酸9種、必需氨基酸7種，按對(duì)應(yīng)峰的保留時(shí)間由短到長(zhǎng)（2.818～20.525min）依次為門(mén)冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定超聲波輔助提取三明藥用植物金線蓮中總氨基酸的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40（g∶mL）、超聲波功率60W、提取溫度60℃、提取2次，每次提取40min，在此條件下，總氨基酸提取率達(dá)到9.86%。該方法與傳統(tǒng)的醇溶劑浸提法相比，具有操作簡(jiǎn)單、快速、高效、無(wú)需加熱、提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

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