深海枝芽胞桿菌A493產(chǎn)生的新活性物質(zhì)Z11的抗菌機(jī)理

黃 典，陳 莉，邵宗澤，孫風(fēng)琴，張少博，林 達(dá)，張鼎楠，喻子牛，張吉斌

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心，湖北 武漢430070；2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361005）

細(xì)菌病害是一類重要的植物病害，每年都造成重大的農(nóng)作物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失。目前，防治植物細(xì)菌病害主要以化學(xué)防治為主、生物防治為輔，但由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中化學(xué)農(nóng)藥的過量使用，其產(chǎn)生的各種問題諸如對(duì)環(huán)境、人類健康和非靶標(biāo)生物的危害等，使得化學(xué)防治受到很大的限制［1，2］。因此，植物細(xì)菌病害的生物防治越來越受到人們的關(guān)注［3－6］。目前國(guó)內(nèi)外主要利用陸地微生物來進(jìn)行植物細(xì)菌病害的防治工作，利用海洋微生物的相關(guān)報(bào)道不多。

研究者從深海分離得到一株枝芽胞桿菌（Virgibacillus dokdonensis）A493，其產(chǎn)生的新活性物質(zhì)Z11經(jīng)初步鑒定為新型的氨基糖苷類化合物，對(duì)植物細(xì)菌水稻黃單胞菌有較強(qiáng)拮抗效果。作者在此以水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）為研究對(duì)象，研究新活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌生理、生化方面的影響，了解其抗菌機(jī)理，擬為生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種來源

水稻黃單胞菌，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心（CCAM）提供；深海枝芽胞桿菌A493（MCCC1A00493），由國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室邵宗澤研究員鑒定并提供。

1.2 培養(yǎng)基

海洋細(xì)菌培養(yǎng)基（2216E）：蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉浸粉1g，乙酸鈉1g，硝酸銨0.2g，檸檬酸鈉0.5g，檸檬酸鐵0.1g，人工海水定容至1L，終pH＝7.6±0.2。

人工海水配方：氯化鈉19.45g，氯化鎂0.75g，硫酸鎂0.75g，氯化鈣1g，氯化鉀0.55g，碳酸氫鈉0.16g，溴化鉀0.08g，氯化鍶34mg，硼酸22mg，硅酸鈉4mg，氟化鈉2.4mg，磷酸氫二鈉8mg，氯化錳0.5mg，硫酸銅0.5mg，硫酸鋅10mg，純水定容至1L。

水稻黃單胞菌培養(yǎng)基（協(xié)本氏培養(yǎng)基PSA）：馬鈴薯300g，蔗糖15g，十二水合磷酸氫二鈉2g，四水合硝酸鈣0.5g，蛋白胨5.0g，蒸餾水1L。相應(yīng)固體培養(yǎng)基按1.5%～2.5%瓊脂粉配制。

1.3 儀器

高速離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，冷凍離心機(jī)，超聲破碎儀，紫外分光光度計(jì)，DU730型核酸蛋白分析儀，DDS－801A型電導(dǎo)儀，Waters高效液相色譜儀，C18色譜柱（4.6mm×250mm），50μL進(jìn)樣針。

1.4 方法

1.4.1 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌生長(zhǎng)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的水稻黃單胞菌細(xì)胞，按1%接種量接種于5mL PA瓶中，設(shè)置7個(gè)濃度梯度，分別加入活性物質(zhì)Z11 0μL、5μL、10μL、20μL、40μL、80μL、160μL，終濃度（μg·mL－1）分別為0、14、28、56、112、224、448；于28℃、180r·min－1恒溫振蕩培養(yǎng)24h；再于4℃、8000r·min－1離心30min，收集沉淀；用生理鹽水洗滌3次后，離心，將沉淀用等體積生理鹽水懸浮，測(cè)定其OD600值。檢測(cè)不同濃度活性物質(zhì)Z11作用下的水稻黃單胞菌生長(zhǎng)情況。

1.4.2 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌蛋白質(zhì)合成的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的水稻黃單胞菌細(xì)胞，按1%接種量接種于5mL PA瓶中，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別加入活性物質(zhì)Z11 0μL、5μL、10μL、20μL、40 μL，終濃度（μg·mL－1）分別為0、14、28、56、112；于28℃、180r·min－1恒溫振蕩培養(yǎng)24h；再于4℃、8000r·min－1離心30min，收集沉淀；用生理鹽水洗滌3次后，離心，將沉淀用等體積生理鹽水懸浮，測(cè)定其OD600值；取1.5mL菌懸液經(jīng)冰浴超聲波（300W）破碎菌體（3min，每次3s，間隔3s），于3000r·min－1離心30min；取上清液在核酸蛋白分析儀上測(cè)定280nm和260nm處的吸光度。按下式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：

蛋白質(zhì)濃度（mg·mL－1）＝1.45OD280－0.74OD260（1）

1.4.3 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)液2mL，于8000r·min－1、4℃離心30min，收集沉淀，用ddH2O洗滌沉淀3次，再用0.9%NaCl懸浮至5mL，分別加入活性物質(zhì)Z11 0μL、5μL、10μL、20μL，終濃度（μg·mL－1）分別為0、14、28、56，充分搖勻，作用0min、30min、60 min、90min、120min、150min后測(cè)定其電導(dǎo)率。

1.4.4 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌細(xì)胞壁合成關(guān)鍵酶的影響

以尿苷三磷酸（UTP）和N－乙酰葡糖胺－1－磷酸（GlcNAc－1－P）為反應(yīng)底物，在水稻黃單胞菌細(xì)胞壁合成關(guān)鍵酶N－乙酰葡糖胺－1－磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（GlmU）的催化作用下生成尿苷二磷酸－N－乙酰葡糖胺（UDP－GlcNAc），通過HPLC檢測(cè)活性物質(zhì)Z11加入前后反應(yīng)的產(chǎn)物量即可計(jì)算酶活抑制率，以反映活性物質(zhì)Z11對(duì)GlmU酶的抑制效果。

反應(yīng)體系：15μL Buffer（50mmol·L－1Tris－HCl、10mmol·L－1MgCl2、1mmol·L－1DTT）、10μL 2mmol·L－1UTP和10μL 2mmol·L－1GlcNAc－1－P作為反應(yīng)底物、2μL活性物質(zhì)Z11作為抑制劑、5μL GlmU酶最后加入。在37℃反應(yīng)10min后，于沸水中煮10min終止反應(yīng)；然后于12 000r·min－1離心5min；反應(yīng)混合物以20mmol·L－1、pH值為5.0的三乙胺醋酸（TEAA）＋0.35%甲醇為流動(dòng)相，流速1mL·min－1，室溫下分離底物和產(chǎn)物，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量為20μL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，記錄HPLC譜圖中產(chǎn)物峰面積，按下式計(jì)算酶活抑制率：

式中：S0、S1分別為加入活性物質(zhì)Z11前后產(chǎn)物的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌生長(zhǎng)的影響（表1）

表1 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌生長(zhǎng)的影響Tab.1 The effect of active substance Z11on growth of X.oryzae pv.oryzae

由表1可看出，在不同濃度活性物質(zhì)Z11作用下，菌體OD600值之間存在顯著差異，說明活性物質(zhì)Z11能夠顯著影響水稻黃單胞菌的生長(zhǎng)。一定濃度范圍內(nèi)，隨著活性物質(zhì)Z11濃度的增大，OD600值減小，菌體濃度降低，菌體生長(zhǎng)受到抑制；當(dāng)活性物質(zhì)Z11濃度達(dá)到56μg·mL－1之后，可以直接殺死水稻黃單胞菌。

2.2 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌蛋白質(zhì)合成的影響（表2）

表2 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌蛋白質(zhì)合成的影響Tab.2 The effect of active substance Z11on protein synthesis of X.oryzae pv.oryzae

由表2可看出，在不同濃度活性物質(zhì)Z11作用下，菌體蛋白質(zhì)濃度之間存在顯著差異，說明活性物質(zhì)Z11能夠影響水稻黃單胞菌蛋白質(zhì)的合成。在抑制菌體生長(zhǎng)的濃度范圍內(nèi)，隨著活性物質(zhì)Z11濃度的增大，蛋白質(zhì)濃度不斷減小，當(dāng)活性物質(zhì)Z11濃度超過56μg·mL－1后，蛋白質(zhì)的合成幾乎停止。

2.3 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響（表3）

表3 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響Tab.3 The effect of active substance Z11on cell membrane permeability of X.oryzae pv.oryzae

由表3可知，在不同濃度活性物質(zhì)Z11作用下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)一致，菌體電導(dǎo)率值之間沒有顯著性差異。說明活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌細(xì)胞膜通透性沒有影響。

2.4 活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌細(xì)胞壁合成關(guān)鍵酶的影響

催化反應(yīng)底物和產(chǎn)物的高效液相色譜見圖1。

圖1 催化反應(yīng)底物和產(chǎn)物的高效液相色譜Fig.1 The HPLC spectrum of substrate and product in the catalytic reaction

由圖1數(shù)據(jù)計(jì)算，加入活性物質(zhì)Z11前后產(chǎn)物的峰面積分別為928386.7±32046.7、744613.3±34679.1，活性物質(zhì)Z11對(duì)GlmU酶的抑制率為（19.74±3.55）%。表明活性物質(zhì)Z11對(duì)GlmU酶存在一定抑制效果，GlmU酶蛋白可能為潛在靶標(biāo)之一。

2.5 討論

深海枝芽胞桿菌A493所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)Z11為一種新型的氨基糖苷類活性物質(zhì)，前期研究顯示活性物質(zhì)Z11耐酸堿、耐高溫、性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜窄，推測(cè)其抗菌機(jī)理具有特異性，本研究結(jié)果顯示新活性物質(zhì)Z11并不改變病原菌細(xì)胞膜的通透性能，但是能夠明顯影響病原菌蛋白質(zhì)的合成，可能在病原菌核糖體內(nèi)存在其相應(yīng)的作用靶標(biāo)。

肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組成部分，如果肽聚糖的生物合成受阻，細(xì)菌細(xì)胞壁的合成必定會(huì)受到影響。UDP－GlcNAc作為肽聚糖和脂多糖生物合成的一種必需的細(xì)胞質(zhì)前體［7－9］，是細(xì)菌細(xì)胞壁合成所必需的。GlmU酶具有乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性和尿嘧啶轉(zhuǎn)移酶活性，是UDP－GlcNAc生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，GlmU酶受到抑制將直接導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁合成受阻而死亡［10］，HPLC法測(cè)定水稻黃單胞菌GlmU酶活性是根據(jù)核苷酸糖類在254nm處有特征吸收峰，而且不同的核苷酸糖在以三乙胺醋酸為流動(dòng)相時(shí)的保留時(shí)間不同而成功分離底物GlcNAc－1－P、UTP以及產(chǎn)物UDPGlcNAc［11］，為水稻黃單胞菌中潛在靶標(biāo)蛋白的尋找和驗(yàn)證提供了一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、可行的方法。

3 結(jié)論

以一株抗菌譜窄的深海枝芽胞桿菌（Virgibacillus dokdonensis）A493為研究對(duì)象，對(duì)其產(chǎn)生的新的氨基糖苷類抗菌活性物質(zhì)Z11抑制水稻黃單胞菌的濃度范圍和抗菌作用機(jī)理進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：Z11抑制水稻黃單胞菌的濃度范圍為14～56μg·mL－1；活性物質(zhì)Z11不改變水稻黃單胞菌細(xì)胞膜通透性，但能影響其蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞壁合成關(guān)鍵酶N－乙酰葡糖胺－1－磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（GlmU）的活性，從而影響其細(xì)胞壁的合成及其完整性。研究結(jié)果說明活性物質(zhì)Z11對(duì)水稻黃單胞菌的作用機(jī)制是多方面的，但是，明確其抗菌分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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