乙?；邹继J醇通過(guò)調(diào)節(jié)縫隙連接蛋白43表達(dá)減輕海水淹溺型急性肺損傷

馬李杰 李艷燕 趙詣林 劉雪英謝永宏 梁 力 南巖東 穆德廣李王平 金發(fā)光

2710032 陜西西安，第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)教研室

馬李杰，李艷燕，趙詣林，等.乙?；邹继J醇通過(guò)調(diào)節(jié)縫隙連接蛋白43表達(dá)減輕海水淹溺型急性肺損傷［J/CD］.中華肺部疾病雜志:電子版，2013，6(1):15-19.

淹溺是普遍的公共衛(wèi)生和健康問(wèn)題，每年造成 大量人員傷亡，并且受害者多為兒童和青少年。淹溺除導(dǎo)致受害者直接死亡外，也能導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，如不及時(shí)治療或治療不當(dāng)可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］。淹溺導(dǎo)致肺損傷的嚴(yán)重程度與進(jìn)入肺的水量和水的清潔程度有關(guān)。目前研究表明，海水吸入導(dǎo)致的肺損傷明顯比淡水嚴(yán)重［2］，海水能夠引起肺部明顯的水腫和炎癥反應(yīng)。另外，有研究表明，肺部炎癥的發(fā)生、發(fā)展和擴(kuò)散與細(xì)胞間的縫隙連接和細(xì)胞間通訊功能密切相關(guān)［3］。

縫隙連接蛋白(connexin，Cx)是細(xì)胞間直接相連并構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接的一類(lèi)膜蛋白。每六個(gè)啞鈴形的連接蛋白亞單位可形成連接子，在連接子的中央存在一個(gè)親水性的通道，允許分子量小于1.5 ×103的小分子如，Ca2+、cAMP、cGMP、氨基酸、葡萄糖、核苷酸、維生素等物質(zhì)通過(guò)，進(jìn)而形成細(xì)胞間的通訊功能 (gapjunctionintercellular communication，GJIC)［4］。肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)的 Cx有Cx26、Cx32、Cx43，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的主要有Cx37、Cx40、Cx43。Cx43是肺泡細(xì)胞表達(dá)的最主要的Cx，調(diào)控對(duì)急性肺損傷至關(guān)重要的Ca2+信號(hào)通路，是肺部炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)［5］。

乙?；邹继J醇(3，5，4＇-tri-O-acetylresveratrol)是白藜蘆醇 (resveratrol)的前藥，在體內(nèi)代謝為白藜蘆醇發(fā)揮藥理活性，后者具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老和心腦血管保護(hù)等多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性，近年來(lái)備受關(guān)注［6-7］。本研究通過(guò)復(fù)制大鼠海水淹溺致急性肺損傷(seawater drowning induced acute lung injury，SWD/ALI)模型，觀察乙?；邹继J醇的治療作用，并探討Cx43參與其中的相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)試劑

乙?；邹继J醇由第四軍醫(yī)大學(xué)化學(xué)教研室合成提供，高效液相 (highperformanceliquid chromatography，HPLC)檢測(cè)純度達(dá)到99%以上，用5‰羧甲基纖維素鈉(cardoxymethyl cellulose sodium，CMCNa)溶液制成混懸液灌胃給藥。海水配方由中國(guó)國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供，滲透壓1250 ～1350 mmol/L，pH 8.20，密度1.05～1.06 g/L。Cx43 和 β-actin 單克隆抗體購(gòu)于安博生物技術(shù)有限公司。TNF-α和IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)于R＆D公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量220 g左右，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用完全隨機(jī)的方法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為四組:A:空白對(duì)照組，B:海水淹溺組，C:乙?；邹继J醇預(yù)處理組和D:乙酰化白藜蘆醇組，每組8只。從造模前7 d開(kāi)始，各組大鼠分別灌胃:A和B組:生理鹽水;C和D組:乙?；邹继J醇150 mg/kg。第七次灌胃90 min后，A和D組大鼠放血處死。B和C組大鼠制做海水淹溺型急性肺損傷模型，造模4 h后放血處死收集取肺組織標(biāo)本。

三、檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.肺組織病理學(xué)檢查:取各組大鼠相同部位肺組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。

2.肺組織濕干比(W/D)測(cè)定:取每只大鼠相同部位肺組織，擦拭血跡后立即稱(chēng)量得組織濕重，將肺組織標(biāo)本置于70℃烘干箱中72 h至恒重，稱(chēng)量干重，計(jì)算濕干比(W/D)。

3.TNF-α檢測(cè):用ELISA的方法檢測(cè)肺組織勻漿中TNF-α的含量，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Cx43 mRNA表達(dá):采用Trizol法提取肺組織標(biāo)本RNA，應(yīng)用Du-640紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的純度，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參照。HIF-1α上游引物:5’-GGAAATCGAACGGCTGGGCGT-3’，下游引物:5’-TCGCGTGAAGGGAAGAAGCGAT-3’，β-actin 上游引物:5’-GCACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3’，下游引物:5’-ACGGTCAGGTCATCACTATCGG-3’，擴(kuò)增條件為:95℃/2 min;95℃/2 min;95℃/10 s;60℃/30 s;70℃/45 s;共40個(gè)循環(huán);之后自動(dòng)4℃保存。所得CT值采用2-ΔΔc(t)法進(jìn)行分析。

5.免疫組化檢測(cè)肺組織中Cx43表達(dá):肺組織標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用鏈霉親和素 －生物素 －酶復(fù)合物(streptavidin biotin complex，SABC)法進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟按試劑盒說(shuō)明操作，DAB顯色，光鏡下觀察肺組織細(xì)胞漿及細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野(400×)，計(jì)數(shù)表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞個(gè)數(shù)，檢測(cè)表達(dá)量的差異。

結(jié) 果

一、病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯病理變化;海水淹溺組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，局部伴有肺不張，間質(zhì)水腫;肺泡內(nèi)可見(jiàn)出血灶，肺間質(zhì)肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞;乙?；邹继J醇預(yù)處理組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，間質(zhì)水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變明顯減輕;乙酰化白藜蘆醇組未見(jiàn)明顯異常(圖1)。

圖1 病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

二、肺組織濕干比(W/D)結(jié)果

吸入海水4 h后，肺組織濕干比(W/D)明顯增高(P＜0.05)，乙?；邹继J醇預(yù)處理能夠明顯降低肺組織的含水量，減小濕干比(P＜0.05)(圖2)。

圖2 濕干比(W/D)結(jié)果

三、ELISA檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，海水淹溺組大鼠肺組織中TNF-α明顯升高(P＜0.05)，乙酰化白藜蘆醇預(yù)處理組大鼠肺組織中TNF-α含量比海水淹溺組明顯降低(P＜0.05)。乙酰化白藜蘆醇組肺組織中TNF-α含量與正常對(duì)照組無(wú)明顯差別(圖3)。

圖3 TNF-α檢測(cè)結(jié)果

四、Cx43 mRNA表達(dá)結(jié)果

正常對(duì)照大鼠基因表達(dá)水平視為“1”，其它各組與之相比較，得出相對(duì)表達(dá)量。大鼠吸入海水后，Cx43 mRNA表達(dá)量升高明顯(P＞0.05)。乙?；邹继J醇預(yù)處理大鼠吸入海水后肺組織中Cx43 mRNA表達(dá)量仍然顯著增高(P＜0.05)(圖4)。

圖4 Cx43 mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

五、Cx43免疫組化結(jié)果

大鼠吸入海水后，肺組織中Cx43染色陽(yáng)性細(xì)胞減少，乙?；邹继J醇預(yù)處理大鼠吸入海水后肺組織中陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)較淹溺組明顯增多(圖5)。

圖5 Cx43免疫組化結(jié)果

討 論

海水吸入最主要的致死原因是喉頭、氣管痙攣或大量液體進(jìn)入肺泡導(dǎo)致的急性窒息，肺部的主要病理生理學(xué)變化為肺水腫和炎癥反應(yīng)。由于海水特有的高滲特性，進(jìn)入肺泡后，迅速引起肺水腫［8］。同時(shí)，有動(dòng)物試驗(yàn)研究表明，淹溺肺損傷動(dòng)物模型肺組織中MPO，TNF-α 和 IL-1β 表達(dá)量增高［9］，表明海水對(duì)肺泡組織的直接損傷及海水淹溺后肺部急性炎癥反應(yīng)是其可能的發(fā)病機(jī)制。在本研究中，我們觀察到吸入海水4 h后，大鼠肺水腫明顯，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)炎癥因子表達(dá)量也明顯增高。通過(guò)乙?；邹继J醇預(yù)處理的大鼠吸入海水后相關(guān)損傷有所減輕，同時(shí)炎癥反應(yīng)也得到一定程度緩解。

ALI和ARDS發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的重要特征是肺泡壁和肺間質(zhì)水腫導(dǎo)致呼吸膜屏障功能紊亂和微血管通透性增加，大量富含蛋白的液體從血管和組織間隙進(jìn)入肺泡腔，加重缺氧和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而增加ALI/ARDS的病死率［10］。研究表明，通訊功能降低可導(dǎo)致肺微血管通透性增加［11］。另外，Cx43表達(dá)量與單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性呈負(fù)相關(guān)系［12］。本研究觀察到，大鼠吸入海水后，在肺水腫發(fā)生的同時(shí)伴有肺組織中Cx43蛋白表達(dá)量降低，而乙?；邹继J醇通過(guò)提高Cx43的表達(dá)量減輕了肺水腫。

炎癥反應(yīng)是一系列復(fù)雜的病理過(guò)程，包括趨化因子、細(xì)胞因子的釋放，單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的活化和遷移。而這些過(guò)程的發(fā)生都需要細(xì)胞間通訊功能的協(xié)調(diào)，細(xì)胞間的縫隙連接形成的跨膜通道為相鄰細(xì)胞的物質(zhì)交換和信息傳遞提供了快捷途徑。有研究表明，連接蛋白Cx43可通過(guò)調(diào)控Ca2+信號(hào)通路調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)的發(fā)展［3，5］。在本試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠吸入海水后導(dǎo)致Cx43蛋白表達(dá)量降低，肺部炎癥反應(yīng)明顯，但乙酰化白藜蘆醇通過(guò)調(diào)控Cx43蛋白表達(dá)可緩解肺損傷。

近年來(lái)，Cx在肺組織中的表達(dá)和功能的研究逐漸增多，多種急/慢性肺臟病中都有涉及Cx。有研究表明脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)能夠引起肺組織中Cx43 mRNA表達(dá)增高［13］，也有研究表明槍傷能夠造成兔肺組織中Cx40表達(dá)量降低，造成水腫和炎癥反應(yīng)［11］。在我們的試驗(yàn)中，海水吸入導(dǎo)致大鼠肺組織中Cx43 mRNA表達(dá)增高，而蛋白表達(dá)降低，說(shuō)明海水能夠促進(jìn)Cx43 mRNA轉(zhuǎn)錄但抑制其翻譯。乙?；邹继J醇預(yù)處理組大鼠吸入海水后肺組織中Cx43 mRNA和蛋白含量均較淹溺組大鼠增高，說(shuō)明乙?；邹继J醇通過(guò)促進(jìn)Cx43的轉(zhuǎn)錄和翻譯可保護(hù)海水淹溺型急性肺損傷。

總之，我們的結(jié)果證實(shí)細(xì)胞間的通訊功能在海水淹溺型急性肺損傷中發(fā)揮重要作用。Cx43表達(dá)降低促使肺水腫和肺部炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而乙?；邹继J醇能夠促進(jìn)Cx43的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而減輕肺損傷。這些結(jié)果部分解釋了海水淹溺的發(fā)病機(jī)制，并為乙酰化白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 楊 昱，王關(guān)嵩，鄧朝霞，等.海水淹溺型肺損傷與淡水淹溺型肺損傷特征的比較［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，34(4):393-396.

2 Rui M，Duan Y Y，Zhang X H，et al.Urinary trypsin inhibitor attenuates seawater-induced acute lung injury by influencing the activities of nuclear factor-kB and its related inflammatory mediators［J］.Respiration，2012，83(4):335-343.

3 Parthasarathi K，Ichimura H，Monma E，et al.Connexin 43 mediates spread ofCa2+-dependentproinflammatory responsesin lung capillaries［J］.J Clin Invest，2006，116(8):2193-2200.

4 Kanczuga-Koda L，Sulkowski S，Tomaszewski J，et al.Connexins 26 and 43 correlate with Bak，but not with Bcl-2 protein in breast cancer［J］.Oncol Rep，2005，14(2):325-329.

5 Scheckenbach KE，Crespin S，Kwak BR，et al.Connexin channeldependent signaling pathways in inflammation［J］.J Vasc Res，2011，48(2):91-103.

6 Li L.The study of pharmacokinetics of 3，5，4'-tri-O-acetylresveratrol and resveratrol in SD rats［D］.Xi＇an China:the Fourth Military Medical University，2011.

7 Neves A R，Lucio M，Lima J L，et al.Resveratrol in medicinal chemistry:a critical review of its pharmacokinetics，drug-delivery，and membrane interactions［J］.Curr Med Chem，2012，19(11):1663-1681.

8 Li J，Xu M，F(xiàn)an Q，et al.Tanshinone IIA ameliorates seawater exposure-induced lung injury by inhibiting aquaporins(AQP)1 and AQP5 expression in lung［J］.Respir Physiol Neurobiol，2011，176(1-2):39-49.

9 Zhang Y，Zhang B，Xu D Q，et al.Tanshinone IIA attenuates seawater aspiration-induced lung injury by inhibiting macrophage migration inhibitory factor［J］.Biol Pharm Bull，2011，34(7):1052-1057.

10 Mann A，Early G L.Acute respiratory distress syndrome［J］.Mo Med，2012，109(5):371-375.

11 Li Q，Zhang J，Wang W，et al.Connexin40 modulates pulmonary permeability through gap junction channel in acute lung injury after thoracic gunshot wounds［J］.J Trauma，2010，68(4):802-809.

12 王 琪.縫隙連接蛋白43研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合研究，2010，2(6):312-316.

13 Fernandez-Cobo M，Gingalewski C，De Maio A.Expression of the connexin 43 gene is increased in the kidneys and the lungs of rats injected with bacterial lipopolysaccharide［J］.Shock，1998，10(2):97-102.