上皮細胞激酶—2與層黏連蛋白5—γ—2在食管鱗癌細胞株TE13中相關性的研究

朱蘇敏 馮亞東 金海林 施瑞華

[摘要] 目的 探討上皮細胞激酶與層黏連蛋白laminin 5-γ-2在食管鱗癌細胞株TE13中表達相關性。 方法 采用細胞免疫組化法檢測EphA2與laminin 5-γ-2在食管鱗狀細胞癌細胞株TE13中的表達相關性；采用RT-PCR方法檢測EphA2與LN5-γ-2 mRNA表達的關系；采用Western Blot法檢測食管鱗狀細胞癌細胞株TE13中經(jīng)RNA干擾技術特異性沉默EphA2后LN5-γ-2蛋白表達的變化。 結果 細胞免疫組化結果顯示LN5-γ-2蛋白在細胞胞漿表達，且沉默EphA2后，LN5-γ-2表達減少。RT-PCR及Western Blot實驗結果顯示在食管鱗狀細胞癌細胞株TE13中，LN5-γ-2 mRNA及蛋白均隨EphA2的沉默而受抑制（P<0.05）。 結論 LN5-γ-2表達受EphA2的調控，可能為EphA2的靶基因。EphA2可能通過調控laminin5-γ-2對食管鱗癌腫瘤血管生成擬態(tài)進行調節(jié)。

[關鍵詞] 食管鱗癌；上皮細胞激酶；層黏連蛋白5-γ-2

[中圖分類號] R735.1???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2012）21-39-03

The correlation of EphA2 and laminin 5-γ-2 in human esophageal cell TE13 line in vitro

ZHU?Sumin1??FENG?Yadong2??JIN?Hailin3??SHI?Ruihua2

1.Medical Center for Digestive Diseases，the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210011，China； 2.Department of Digestion，the First Affiliated Hospital of NJMU，Nanjing 210029，China； 3.Gastrointestinal Endoscopy Center，Jiangsu Provincial Hospital of TCM，Nanjing 210029，China

[Abstract] Objective To investigate the correlation of EphA2 and laminin 5-γ-2 in human esophageal cell TE13 line in vitro. Methods In the present study，human esophageal squamous cell carcinoma TE13 lines were examined for LN-5 expression immunohistochemically，using an antibody against LN-5-γ-2 chain.TE13 cell line with scilencing EphA2 gene were examined for LN-5-γ- 2?chain levels by Western blotting and RT-PCR. Results Laminin 5-γ-2 could be detected in cytoplasm in TE13 and the level of expression of lamanin 5-γ-2 decreased with silencing EphA2 immunohistochemically.RT-PCR and Western blot showed that the expression of laminin 5-γ-2 in TE13 was inhibited with silencing EphA2（P<0.05）. Conclusion The expression of laminin 5-γ-2 positively correlates with expression of EphA2.Laminin 5-γ-2 may be a potential target gene of EphA2.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma；Epithelial cell kinase；Laminin 5-γ-2

我國是食管癌的高發(fā)區(qū)，研究食管癌的發(fā)病機制、提高早期診斷率、尋找新的治療途徑是食管癌防治的關鍵[1]。食管癌是生長迅速的腫瘤，因此食管癌組織內常常存在著乏氧微環(huán)境。缺氧狀態(tài)可以刺激腫瘤細胞合成和分泌大量促血管生成因子如血管內皮生長因子（VEGF）等，促進腫瘤血管的生成，促進惡性腫瘤生長、浸潤和轉移。血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種存在于高侵襲性腫瘤的血液供應方式，是由腫瘤細胞通過自身變形和基質重塑產生血管樣通道，并與宿主血管相連，使腫瘤獲得足夠血供的一種血管化途徑。VM的存在對腫瘤浸潤、轉移有著巨大影響，與惡性腫瘤的預后密切相關[2-3]。層黏連蛋白（laminin，LN）是一種有多種生物學功能細胞外基質的糖蛋白，它們在基底膜的構建及細胞粘附、生長、遷移和分化中扮演著至關重要的角色[4]。有研究顯示，層黏連蛋白的功能角色（5γ2鏈）在VM形成中發(fā)揮著重要功能[5]。細胞過表達血管生成2（angiopoie.tin-2）能使LN5-γ-2表達上調[6]。EphA2 是Eph亞家族成員中被發(fā)現(xiàn)的具有酪氨酸酶活性的第一個基因編碼產物，其功能涉及調節(jié)胚胎發(fā)育、細胞增殖和遷移及血管生成。本研究組前期研究證實EphA2在食管鱗癌中是高表達的[7]，用EphA2 shRNA質粒穩(wěn)定轉染人食管鱗癌細胞株Eca-109和TE13細胞后，采用Matrigel體外三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在有氧和缺氧條件下，抑制EphA2表達均可使腫瘤細胞管腔形成數(shù)量明顯減少[8]。本研究從腫瘤血管生成擬態(tài)的關鍵因子LN入手，探討EphA2與LN之間的關系，初步探討腫瘤血管生成擬態(tài)的形成環(huán)節(jié)。

1?材料與方法

1.1?細胞株及細胞培養(yǎng)

人低分化食管鱗癌細胞株TE13購自上海細胞所，本研究組已成功構建EphA2shRNA質粒pcDNA6.2-GW/EmGFP shRNA，穩(wěn)定轉染TE13細胞，獲得TE13 EphA2/Neo細胞株和TE13 EphA2/shRNA細胞株。所有細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2及飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2?主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，鼠抗人EphA2購自R&D;公司，兔抗人laminin 5-γ-2抗體購自SantaCruz公司。ProteinA瓊脂糖珠購自Millipore公司。M-MLV逆轉錄試劑購自Fermentas公司。

1.3?逆轉錄PCR（RT-PCR）檢測

TE13細胞、TE13EphA2/Neo細胞和TE13 EphA2/shRNA細胞轉染48 h后倒掉6孔板中的培液，每空加入1 mL的TRIZOL試劑，按照TRIZOL試劑的說明書抽提RNA。之后取1μg的RNA，按照Takara逆轉錄試劑盒的要求將總RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ +∞。引物設計由上海杰瑞生物工程有限公司完成，LN的引物為：上游引物5‘-TGAAGCGTAACCAGCCGACGC-3，下游引物5‘-CACAAACAGCACGTCCGGCTCT-3，以GAPDH為內參，其上游引物為5‘-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGTT-3，下游引物為5‘-GCCGTTGAACTTGCCGTGG-GTAG-3。Q-PCR的條件為95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 cycles，其中以evergreen為熒光染料。

1.4?細胞免疫組化

TE13細胞、TE13EphA2/Neo細胞和TE13 EphA2/shRNA細胞培養(yǎng)24 h，細胞以冰甲醇固定，兔抗人laminin 5-γ-2抗體工作濃度1∶200，以PBS代替一抗作陰性對照。DAB染色，光鏡下觀察細胞胞漿或胞核內出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性。

1.5?Western Blot檢測

TE13細胞、TE13EphA2/Neo細胞和TE13 EphA2/shRNA細胞提取總蛋白，40μg蛋白上樣用5%濃縮膠、10%～15%分離膠進行SDS-PAGE電泳，電轉蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別與相應一抗4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次后與相應辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育2 h。ECL孵育3 min，暗室曝光并洗片。

1.6?統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件SSPS11.0處理，均以（）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?RT-QPCR檢測laminin5-γ-2 mRNA的表達

TE13 EphA2/shRNA細胞中的EphA2（灰度值0.12±0.01）和laminin5-γ-2mRNA（灰度值0.14±0.01）的表達水平明顯低于在TE13細胞（灰度值1，1）和TE13 EphA2/Neo細胞（灰度值0.99±0.01，0.98±0.01）中的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TE13細胞和TE13 EphA2/Neo細胞中EphA2和laminin5-γ-2mRNA的表達水平，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.2?EphA2對laminin5-γ-2在TE13細胞中蛋白表達的影響

EphA2和laminin5-γ-2在TE13中均存在高表達。細胞免疫組化表明，laminin5-γ-2在TE13細胞和TE13 EphA2/Neo細胞胞漿內呈陽性表達，而laminin5-γ-2在TE13 EphA2/shRNA細胞中的表達明顯低于在TE13細胞和TE13 EphA2/Neo細胞中的表達。見圖2。Western Blot檢測表明，在TE13 EphA2/shRNA細胞中，EphA2（灰度值0.10±0.01）和laminin5-γ-2（灰度值0.01±0.00）的蛋白表達水平明顯低于在TE13細胞（灰度值1，1）和TE13 EphA2/Neo細胞（灰度值0.98±0.01，0.99±0.01）中的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TE13細胞和TE13 EphA2/Neo細胞中EphA2和laminin5-γ-2的蛋白表達水平，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

3?討論

EphA2是Eph亞家族成員中被發(fā)現(xiàn)的具有酪氨酸酶活性的第一個基因編碼產物，是1990年Lindberg等[6]從人角化上皮細胞cDNA文庫中篩選得到的。EphA2廣泛表達于人類上皮來源的細胞，包括表皮、肺臟、腸道上皮細胞和卵巢組織等，其功能涉及調節(jié)胚胎發(fā)育、細胞增殖和遷移及血管生成。近年來研究表明，EphA2 在許多腫瘤組織中呈高表達，包括乳腺癌、結腸癌、非小細胞肺癌和胃癌等[9-13]。同時臨床研究還發(fā)現(xiàn)EphA2的高表達與臨床分期、淋巴結轉移及預后密切相關[9-10]。本研究組前期研究也證實EphA2在食管鱗癌中高表達[7]，而且用EphA2 miRNA干擾質粒轉染人食管鱗癌細胞株Eca-109和TE13細胞后，采用Matrigel體外三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在有氧和乏氧條件下，抑制EphA2表達均可使腫瘤細胞管腔形成數(shù)量明顯減少[8]，提示EphA2與食管鱗癌的VM生成密切相關。

層黏連蛋白是一種有多種生物學功能細胞外基質的糖蛋白，它們在基底膜的構建及細胞粘附、生長、遷移和分化中扮演著至關重要的角色[4]。LN-5是1987年Verrando等發(fā)現(xiàn)的，是一個由α3、β3、γ2三條多肽鏈經(jīng)二硫鍵結合的糖蛋白分子。層黏連蛋白-5的功能角色（γ2鏈）在VM形成中發(fā)揮著重要功能[14]。

血管生成擬態(tài)是近十年來腫瘤研究領域提出的新概念。與經(jīng)典的由內皮細胞構成的血管不同，它是由細胞外基質和腫瘤細胞包繞著紅細胞而構成的血管狀結構。目前研究表明EphA2、LN5及VE-cadherin與血管生成擬態(tài)密切相關，筆者在前期研究中通過沉默VE-cadherin的表達，發(fā)現(xiàn)TE13細胞形成VM的能力下降，同時EphA2和laminin5-γ-2的蛋白表達水平也出現(xiàn)下降，可見VE-cadherin通過調節(jié)EphA2和laminin5-γ-2表達水平來影響TE13細胞形成VM的能力的[7]。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)在TE13 EphA2/shRNA細胞中，laminin5-γ-2在mRNA水平及蛋白水平上表達明顯較TE13細胞和TE13 EphA2/Neo細胞下降，這提示laminin5-γ-2可能接受EphA2的調控，是EphA2的下游基因。EphA2可能是通過調控laminin5-γ-2來對食管鱗癌腫瘤血管生成擬態(tài)進行調節(jié)的。

綜上所述筆者發(fā)現(xiàn)，laminin5-γ-2可能接受EphA2的調控，是EphA2的下游基因。EphA2可能通過調控laminin5-γ-2來對食管鱗癌腫瘤血管生成擬態(tài)進行調節(jié)。上述結果讓筆者對血管生成擬態(tài)的發(fā)生機制有了進一步的認識，為生物治療食管癌提供了一定的理論基礎。

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（收稿日期：2012-09-11）