葉酸在缺血/再灌注損傷中的作用

王若禺 崔術(shù)楠 邢宏義

(1.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢430022；2.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢 430022)

葉酸是B族維生素的一種，本身不具有生物活性，葉酸在肝臟轉(zhuǎn)換成二氫葉酸再轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸并具有生物活性[1]。同型半胱胺酸并不是從食物中獲得的，而是甲硫氨酸經(jīng)代謝得到的。缺乏維生素B6、葉酸和B12可導(dǎo)致高同型半胱胺酸血癥。高同型半胱胺酸血癥的患者發(fā)生血栓形成和心腦血管疾病的概率相比正常人群更高[2]。葉酸在缺血/再灌注的多個(gè)環(huán)節(jié)中起保護(hù)作用，該文將通過高同型半胱胺酸血癥、核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)激活以及內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)解聯(lián)合等環(huán)節(jié)闡述葉酸缺乏可促進(jìn)缺血/再灌注損傷。

1 葉酸缺乏導(dǎo)致缺血/再灌注損傷

1.1高同型半胱胺酸血癥 目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，高同型半胱胺酸血癥是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，高同型半胱胺酸血癥可導(dǎo)致血管功能異常。有研究指出，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，同型半胱胺酸促進(jìn)單核細(xì)胞驅(qū)化蛋白1(monocyte chemoattractant protain-1，MCP-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1和E-選擇素的表達(dá)，導(dǎo)致單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮[3]。在實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)普通飲食配合1.7%的甲硫氨酸飲食四周，導(dǎo)致血液中同型半胱胺酸濃度急劇升高，同時(shí)單核細(xì)胞的驅(qū)化和黏附運(yùn)動(dòng)相比對(duì)照組(無甲硫氨酸飲食)也明顯增加(292% vs.100%)。免疫組織化學(xué)的結(jié)果表明高同型半胱胺酸的大鼠，其血管內(nèi)皮MCP-1的含量明顯增多，這表明同型半胱胺酸能夠誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)中被預(yù)先注入MCP-1的抗體再用甲硫氨酸喂養(yǎng)，與對(duì)照組相比單核細(xì)胞的驅(qū)化運(yùn)動(dòng)無顯著性差異[3]。用血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1和E-選擇素預(yù)先處理的實(shí)驗(yàn)中也得到了相似的結(jié)果[3-4]。以上這些結(jié)果表明，高同型半胱胺酸血癥通過激活MCP-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1和E-選擇素的表達(dá)來驅(qū)化單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮的損傷。

1.2DNA損傷以及高能磷酸化合物耗盡 多個(gè)研究表明，大腦缺血/再灌注損傷可以導(dǎo)致缺血區(qū)域DNA的損失，但在心肺的缺血/再灌注損傷中，還未有DNA損傷的報(bào)道[5-6]。Endres等[4]發(fā)現(xiàn)，同型半胱胺酸可以加重腦組織的再灌注損傷。AP位點(diǎn)(Apurinic/apyrimidinic abasic sites, AP sites)是一種檢測DNA損傷程度的試劑盒，實(shí)驗(yàn)組予以無葉酸飲食，對(duì)照組給予葉酸飲食，兩組都制作大腦中動(dòng)脈栓塞模型，再灌注后實(shí)驗(yàn)組AP sites的染色程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，說明無葉酸飲食可以加重DNA的損傷。最主要的原因是葉酸的缺乏導(dǎo)致胸嘧啶合成的缺乏。葉酸是參與轉(zhuǎn)移甲基的重要輔酶，而胸腺嘧啶合成需要轉(zhuǎn)甲基過程的參與。葉酸的缺乏可導(dǎo)致胸腺嘌呤合成不足，那么尿嘧啶可能會(huì)被誤編入DNA中，從而導(dǎo)致DNA的損傷。同樣，黃嘌呤的合成也需要葉酸及轉(zhuǎn)甲基的參與，黃嘌呤再經(jīng)過加工可以合成腺苷酸(adenosine monophosphate，AMP)和鳥苷酸(guanosine monophosphate，GMP)。葉酸的缺乏不僅導(dǎo)致胸腺嘧啶的缺乏，還可以影響AMP和GMP的合成。AMP是三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的合成原料，GMP是環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)第二信使的合成原料，同時(shí)另一種第二信使環(huán)磷酸腺苷的合成也受到影響。葉酸的缺乏可以降低細(xì)胞內(nèi)AMP和GMP的濃度，導(dǎo)致第二信使合成的量不足，從而影響細(xì)胞間通信的效率，但是還沒有客觀的指標(biāo)可以證明這一觀點(diǎn)。一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種重要的擴(kuò)血管藥物，它通過促進(jìn)血管平滑肌cGMP的合成最終促進(jìn)血管的舒張[7]。葉酸的缺乏可同時(shí)導(dǎo)致NO和cGMP的減少，從而影響再灌注時(shí)血管的舒張，影響缺血區(qū)血流灌注。

在缺血/再灌注中受到損傷的細(xì)胞，需要用AMP、GMP和胸苷酸來修復(fù)受損的DNA；缺少這些原料修復(fù)過程會(huì)受阻，那么細(xì)胞將會(huì)開始凋亡的過程。在缺血/再灌注損傷中，凋亡是組織受損傷的一種重要的形式，Caspase蛋白家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的重要通路(圖1)。如果DNA損傷超過一定的閾值，Caspase蛋白就會(huì)被激活，然后活化更多的蛋白酶，將DNA水解成200個(gè)堿基對(duì)或其倍數(shù)大小的片段，通過DNA凝膠電泳可以發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。Endres等發(fā)現(xiàn)，用了Caspase的抑制劑后，缺血/再灌注損傷動(dòng)物(大腦中動(dòng)脈栓塞模型)的腦組織損傷明顯減輕[4]。由于葉酸的缺乏可以導(dǎo)致DNA損傷，而缺血/再灌注損傷是加重DNA損傷的重要過程，所以葉酸缺乏的動(dòng)物模型缺血/再灌注損傷的程度更重(圖2)。

缺血的過程使得TNF-α的釋放，以及白細(xì)胞表面Fas配體的激活；兩者都可激活Caspase系統(tǒng)，引起細(xì)胞凋亡。圖中，TNF-α:腫瘤壞死因子-α；Fas-L:Fas配體；CAD:Caspase激活的DNA水解酶；DNA fragmentation:DNA裂解；Apoptosis:凋亡

圖1 Caspase家族參與凋亡的過程[8]

葉酸缺乏引起GMP、AMP和TMP合成障礙，一方面高能磷酸化合物合成減少，cGMP合成減少，影響血管的舒張功能，血管出現(xiàn)痙攣的現(xiàn)象；另一方面，DNA損傷加重而不能修補(bǔ)，Caspase激活引起凋亡，可能加重再灌注損傷。圖中cGMP:環(huán)磷酸鳥苷；GMP:鳥苷酸；AMP:腺苷酸；TMP:胸苷酸。↑：加重；↓：受抑制；?：表示暫時(shí)沒有非常明確的文獻(xiàn)指出Caspase激活導(dǎo)致再灌注損傷加重

圖2 葉酸缺乏導(dǎo)致灌注損傷加重的機(jī)制[5-8]

1.3核因子kappa B激活 在心血管和腎臟等疾病中，核因子kappa B( nuclear factor kappa B, NF-κB)上調(diào)炎性因子的表達(dá)，起到重要的作用[9-10]。NF-κB是一個(gè)二聚體蛋白，一方面可以與DNA結(jié)合，另一方面還可以與核因子κB抑制蛋白(NF-κB inhibitor, IκB)結(jié)合，IκB是NF-κB的抑制蛋白，一般情況下與NF-κB結(jié)合成為二聚體，抑制NF-κB的活性。高同型半胱胺酸血癥的患者動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程中，NF-κB所起到的作用已經(jīng)基本被闡釋清楚了[9]。首先是同型半胱胺酸通過多種途徑致使IκB磷酸化并改變結(jié)構(gòu)，與NF-κB脫離。NF-κB游離后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與某些基因的啟動(dòng)子結(jié)合，并調(diào)節(jié)和促進(jìn)這些基因表達(dá)[11]，這些基因中就有MCP-1基因。有研究表明，高同型半胱胺酸血癥的大鼠腎臟，其IκB的含量明顯低于正常血同型半胱胺酸濃度的大鼠，凝膠電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-κB與DNA結(jié)合的比率大大提高[12-13]。用NF-κB的抑制劑預(yù)處理高同型半胱胺酸血癥的大鼠可以發(fā)現(xiàn)，MCP-1的表達(dá)明顯減少[9-10]。這些結(jié)果共同表明，同型半胱胺酸可以激活NF-κB，并促進(jìn)某些蛋白如MCP-1的表達(dá)。

到目前為止一氧化氮合成酶共有3種形式：神經(jīng)一氧化氮合成酶，可誘導(dǎo)一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和eNOS。iNOS可過量產(chǎn)生NO，NO經(jīng)過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生自由基，攻擊組織中的蛋白，形成硝基-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而導(dǎo)致組織的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，高甲硫氨酸飲食喂養(yǎng)大鼠4周后，大鼠組織中iNOS的mRNA和蛋白表達(dá)都明顯增加[9]。免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示，高甲硫氨酸飲食的大鼠，其腎臟組織硝基-蛋白質(zhì)復(fù)合物的濃度明顯高于正常飲食的大鼠[9]。使用NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷或-乙酰-半胱氨酸[14]后，不僅NF-κB的激活明顯減少，而且iNOS mRNA的表達(dá)也明顯降低(圖3)。

葉酸缺乏引起同型半胱氨酸濃度的升高，激活NF-κB，一方面激活MCP-1表達(dá)，增加單核細(xì)胞的驅(qū)化，增加再灌注的損傷；另一方面激活iNOS的表達(dá)，過量的NO產(chǎn)生自由基，增加再灌注的損傷。圖中，ONOO-和O2-為自由基，↑：上調(diào)

圖3 NF-κB激活參與葉酸缺乏引起的再灌注損傷[9-11,15]

1.4eNOS解聯(lián)合與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化 eNOS、iNOS和nNOS都是二聚體蛋白，它們單體的羧基端都與另一單體的氨基端相銜接，構(gòu)成氧化還原酶的結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域又與四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopteri , BH4)相聯(lián)合[16]。三種NOS的氧化還原過程如下：第一步，NOS將L-精氨酸氧化成N-羥基-L-精氨酸；第二步，NOS將N-羥基-L-精氨酸氧化成L-瓜氨酸并生成NO。在合成NO的過程中，電子從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)中轉(zhuǎn)移到NO和L-瓜氨酸。如果從NADPH到NO的電子傳遞鏈被打斷，將造成大量過氧化物的產(chǎn)生，這一過程叫做NOS的解聯(lián)合[17]。

NADPH依賴的氧化酶是細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基的產(chǎn)生主要來源，它由膜結(jié)合的組件(GP91PHOX和p22phox亞基)和細(xì)胞質(zhì)組分(p47phox，p67phox，p40phox和Rac1/2亞基)[11,18-20]構(gòu)成。有研究結(jié)果顯示，在葉酸缺乏的大鼠模型中，喂養(yǎng)甲硫氨酸12周后，大鼠出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶的活性明顯增高并檢測到過氧化陰離子和脂質(zhì)大量生產(chǎn)。在予以NADPH氧化酶的抑制劑香莢蘭乙酮(apocynin)后，檢測到NADPH氧化酶的活性降低到正常水平，同時(shí)脂質(zhì)的氧化也被抑制[15]。另外，用同型半胱氨酸培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)NADPH氧化酶亞基的表達(dá)水平進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)NADHP氧化蛋白4和p22phox亞基的表達(dá)顯著升高[15,21]。這些證據(jù)表明，NADPH在同型半胱氨酸引起的氧化應(yīng)激中起到了重要的作用。

2 葉酸治療再灌注損傷

2.1增加高能磷酸化合物 葉酸在調(diào)解線粒體功能中起到重要作用。有研究表明，用葉酸喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一周，可以提高組織細(xì)胞中高能磷酸化合物(包括ADP和ATP)的含量[22]。在有氧環(huán)境中，ATP大量合成并保持在一定的濃度水平。在再灌注過程中，ATP由無氧糖酵解產(chǎn)生，因此磷酸肌酸等高能磷酸化合物不能滿足組織需要，ATP的凈含量也因此下降。用葉酸治療干預(yù)，由于組織儲(chǔ)存更多的高能磷酸化合物，可以延緩細(xì)胞致死性損傷的發(fā)生。用葉酸預(yù)處理動(dòng)物模型已經(jīng)證明，葉酸可以縮減心肌梗死后的再灌注損傷面積。

2.2增強(qiáng)eNOS與BH4的聯(lián)合 有研究結(jié)果顯示，葉酸的活性形式5-甲基四氫葉酸(5-Methyltetrahydrofolate, 5-MTHF)可以增強(qiáng)BH4與eNOS的聯(lián)合，在5-MTHF的作用下，NO依賴的內(nèi)皮功能迅速提升，過氧化物的生成明顯減少[7]。5-MTHF抑制BH4氧化成BH2，提高BH4的利用，而BH4又可以抑制eNOS的解聯(lián)合，從而減少過氧化物的產(chǎn)生，起到保護(hù)內(nèi)皮的作用。在這項(xiàng)研究中，實(shí)驗(yàn)組予以5-MTHF，對(duì)照組予以安慰劑；實(shí)驗(yàn)組活性BH4與總蝶呤的比值(BH4/tBio)明顯高于對(duì)照組。一項(xiàng)相反結(jié)果的研究表明，高劑量的葉酸對(duì)預(yù)防eNOS解聯(lián)合并未起到作用[23]：首先，高劑量葉酸治療對(duì)高同型半胱氨酸血癥的患者有明顯效果，但對(duì)正常同型半胱氨酸血濃度的患者并不有效[24]；其次，雖然葉酸能夠減少BH4的氧化并且提高BH4/tBio，但葉酸并不能促進(jìn)BH4完全氧化后的產(chǎn)物恢復(fù)到還原狀態(tài)[12]。

有研究探究了葉酸與內(nèi)皮過氧化的關(guān)系，有活性的eNOS可以使熒光染料二氫乙啶(Dihydroethidium, DHE)顯色，而解聯(lián)合的eNOS不能使DHE顯色。實(shí)驗(yàn)組予以5-MTHF，對(duì)照組予以安慰劑。用L-NAME(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester)，eNOS的抑制劑處理對(duì)照組的血管發(fā)現(xiàn)，DHE顯色明顯減弱，說明缺乏葉酸導(dǎo)致eNOS解聯(lián)合。在實(shí)驗(yàn)組中，DHE染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組，說明葉酸可以預(yù)防eNOS的解聯(lián)合[13]。以上這些證據(jù)表明葉酸能夠保護(hù)eNOS，在再灌注中增加內(nèi)皮功能。

2.3保護(hù)內(nèi)皮 內(nèi)皮的功能以及白細(xì)胞的黏附作用直接與血同型半胱胺酸濃度相關(guān)。葉酸不僅降低血中同型半胱胺酸的濃度，從而改善內(nèi)皮功能，而且在保護(hù)內(nèi)皮的過程中起到獨(dú)立的作用。有研究表明，將葉酸給與大鼠，不僅血同型半胱胺酸濃度降低，而且MCP-1表達(dá)受抑制，單核細(xì)胞的黏附作用也受阻[3]。葉酸促進(jìn)血管內(nèi)皮eNOS的活性，NO是由eNOS合成的，NO通過激活cGMP促使血管平滑肌舒張；同時(shí)，NO能抑制白細(xì)胞與血管壁的黏附，NO一方面干擾白細(xì)胞黏附因子CD11/CD18與血管內(nèi)皮的黏附，另一方面抑制白細(xì)胞表達(dá)CD11/CD18。

另外一個(gè)研究用果糖飼喂大鼠，使得大鼠體內(nèi)BH4含量極低，使其內(nèi)皮功能受損。對(duì)照組僅飼喂果糖，實(shí)驗(yàn)組飼喂果糖以及5-MTHF。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠產(chǎn)生更多NO，內(nèi)皮功能更好，其血管半徑相對(duì)更大，在再灌注中損傷更小[25]。

最近的一項(xiàng)研究表明，高劑量葉酸治療和低劑量治療的療效觀察并沒有差別。低劑量的葉酸，相當(dāng)于食用富含葉酸，可以增加內(nèi)皮功能并引起內(nèi)皮功能最大限度地提高。在此基礎(chǔ)上再加大葉酸的劑量對(duì)血管內(nèi)皮功能的改善微乎其微[26]。

2.4大規(guī)模臨床試驗(yàn)表明缺乏證據(jù) 雖然在動(dòng)物模型和體外實(shí)驗(yàn)中，葉酸能減少心肌梗死面積，減輕組織的損傷，但一系列臨床試驗(yàn)不能得出葉酸能夠在梗死中改善缺血的結(jié)論。一項(xiàng)北美的大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)表明，葉酸治療的結(jié)果不盡人意。對(duì)無致殘性腦梗死的患者觀察兩年發(fā)現(xiàn)，大劑量給與葉酸和小劑量給與葉酸的再次發(fā)病率分別為9.2%(166/1814)(RR 1.0， 95%CI 0.8～1.3)和8.8%(161/1835)(RR 1.0，95% CI 0.8～1.3)。在兩年的隨訪中，非致殘腦梗死的患者服用葉酸可以降低血同型半胱胺酸濃度，但不能減少腦血管事件再次發(fā)生的概率[24]。另一個(gè)臨床試驗(yàn)Norwegian Vitamin，參與的志愿者共3749例，都是7 d內(nèi)出現(xiàn)心肌梗死的患者，實(shí)驗(yàn)組予以葉酸和維生素B12，對(duì)照組予以安慰劑。實(shí)驗(yàn)組的同型半胱胺酸濃度低于對(duì)照組的27%，但心血管事件的結(jié)局并無明顯改善。另一實(shí)驗(yàn)組予以葉酸、維生素B6和B12，相比對(duì)照組，得出一個(gè)有害的結(jié)論[27]?？赡艿慕忉屖牵珺族維生素治療心肌梗死的效果并不明顯，但不良反應(yīng)已經(jīng)體現(xiàn)出來了。另外一個(gè)臨床試驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比葉酸治療對(duì)心血管疾病和心肌梗死的病死率并不降低[28]。這些臨床試驗(yàn)得出一個(gè)結(jié)論：葉酸治療缺血性疾病的治療前景悲觀。

雖然臨床試驗(yàn)的結(jié)果比較悲觀，但是實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)之間有一些不同之處，這些差異造成了兩者在結(jié)果上的區(qū)別。首先，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組同型半胱氨酸濃度差異較大，但是臨床試驗(yàn)的組間差別并不是很大。其次，在臨床試驗(yàn)中，唯一評(píng)價(jià)的指標(biāo)是相對(duì)危險(xiǎn)度。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，缺血/再灌注損傷是由動(dòng)脈栓塞引起的，梗死面積、組織染色被用于作為實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的指標(biāo)。這些指標(biāo)并不適合在臨床試驗(yàn)中使用。

3 結(jié) 語

葉酸作為一種重要的維生素，參與了人體的許多重要的生命活動(dòng)，也在再缺血/再灌注損傷中起到了重要的作用。雖然葉酸緩解再灌注損傷的具體機(jī)制不能很清晰地解釋清楚，并且葉酸缺乏導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的機(jī)制也不明，但是葉酸作為一種廉價(jià)和實(shí)用的治療藥物將會(huì)受到熱門地研究以及廣泛地應(yīng)用和推廣。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及研究的進(jìn)一步深入，學(xué)者們終將在葉酸緩解再灌注損傷的具體機(jī)制的研究中有所突破。

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