采用PCR技術對難治性根尖周炎根管糞腸球菌的檢測分析

劉志剛 莫浩勛 王群芳

(東莞市人民醫(yī)院，廣州 東莞 523000)

根管治療的成功率已明顯提高，但對難治性根尖周炎的處理依然難以達到滿意效果，在難治性根尖周炎中，糞腸球菌的存在和研究是關注的熱點。而PCR在口腔領域中的應用則較少，本課題將PCR技術引入口腔疾病治療上進行應用研究，找出一種快捷有效的PCR技術來檢測糞腸球菌的數(shù)量，分析糞腸球菌與難治性根尖周炎的關系，并通過對不同的臨床癥狀與糞腸球菌的存在情況關系進行統(tǒng)計學分析，提示糞腸球菌在難治性根尖周炎中的作用，對難治性根尖周炎給以針對性治療。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

本實驗的臨床樣本采集選自東莞市人民醫(yī)院口腔中心就診的慢性根尖周炎根經(jīng)三次換藥仍有臨床癥狀或體征的患者，擬迄擇共100顆患牙為研究對象，男女性別隨機，年齡段介于14～70歲。所有患者在近3個月內(nèi)未服用過抗生素，無系統(tǒng)病史，閱讀知情同意書后同意參與研究。記錄臨床患者的具體情況：姓名、性別、年齡、牙位、病史，且相關的臨床數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學差異。

1.2 癥狀檢查及記錄

癥狀體征(包括自發(fā)痛、咬合痛、叩痛、牙齦膿腫及瘺道)、影像學特征(根尖周是否有暗影，包括首次治療后未愈合且漸進性增大或新出現(xiàn)的暗影)等。

1.3 標本采集方法

依據(jù)病例選擇標準選取患牙，患牙拋光清潔后，用3%過氧化氧消毒患牙及周圍2 cm直徑范圍各30s，安置橡皮障。 無菌高速手機裂鉆，無菌水冷卻下去除釉質(zhì)、牙本質(zhì)或殘存充填材料后，棉卷隔濕，酒精棉球消毒窩洞，低速球鉆揭去髓室頂。15# K銼探通根管，到達大約根尖孔位置(根尖定位儀)，消毒吸水紙尖插入根管中，吸取根管內(nèi)液(干燥根管滴入少許生理鹽水)，紙尖在根管內(nèi)停留1分鐘后取出。連續(xù)采樣三次，將三支紙尖立即置于同一個盛有1ml 硫乙醇酸鹽傳送培養(yǎng)液的消毒離心管中。 冰浴轉(zhuǎn)送實驗室，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ拥母荛L度的確定和臨床癥狀均由同一位牙體牙髓專業(yè)醫(yī)生檢測和記錄。

1.4 DNA提取

糞腸球菌檢測相關的步驟；首先制定標準菌懸液制備，然后在細菌基因組做DNA的提取(按照細菌基因組快速提取試劑盒(上海捷瑞生物有限公司)的使用說明進行DNA提取。提取結(jié)果5μL用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測細菌基因組DNA的提取結(jié)果)。根據(jù)GenBank中糞腸球菌基因組中16S rRNA的保守序列，參考sedgley等文獻[1]，設計引物．序列為：上游引物5′-CCGAGTG—CTTGCACTCAATTGG-3′;下游引物5′-CTCTTATG—CCATGCGGCATAAAC-3′。預期擴增的片段長度為138 bp。使用前參照說明書用純水稀釋成10μmol.·L，分裝成每管100 μl備用。

1.5 PCR 反應

以提取的糞腸球菌標準株及樣本中的細菌基因組DNA為模板，使用ABT 7500型核酸擴增熒光檢測儀(美國應用生物系統(tǒng)公司，美國)進行PCR擴增，25μl． 反應體系：10×PCR緩沖液5 μl，Mg2+終濃度1.5～2.0 mM，10 mM dNTP 1 μl，5 U/μl Ex Taq酶0.2 μl，25 μmol/L引物各1 μl，cDNA為模板2 μl，去離子水加至50 μl。具體反應條件如下：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)數(shù)，最后一個循環(huán)72 ℃延伸10 min。取PCR擴增液5 μl，加入溴酚藍2 μl，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠(5.0 mg/l溴乙錠染色)，在TAE緩沖液中電泳45 min，紫外與可見分析裝置觀察并記錄。用標準參考物確定產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的大小，電泳結(jié)束后將凝膠置于凝膠成像分析系統(tǒng)(BioRad公司，美國)中進行分析。結(jié)果判定，相對于陽性對照組，在138 bp出現(xiàn)特異性條帶為陽性，否則為陰性。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13 .0軟件進行統(tǒng)計學分析，利用四格表χ2檢驗進行組內(nèi)比較，分析不同癥狀及體征的病例中糞腸球菌的檢出情況。

2 結(jié) 果

將收集的病例分為3組；A組為有臨床癥狀患牙(包括自發(fā)痛、咬合痛)，B組為有體征的患牙(觸痛、叩痛、牙齦膿腫和瘺道)，C組為既有癥狀又有體征的患牙(有根尖周病變)。結(jié)果顯示3組臨床癥狀患牙糞腸球菌檢出率存在差異，但是不符合統(tǒng)計學研究意義。不同癥狀及體征的難治性根尖周炎中糞腸球菌檢出率存在很大的差異，其研究結(jié)果以咬合痛的病例組(62.26%)與瘺道的病例組(71.43%)中中糞腸球菌的檢出率明顯高于其它癥狀表明糞腸球菌的檢出。詳細見表1。

表1 不同臨床癥狀和體征的難治性根尖周炎中糞腸球菌檢出率

3 討 論

難治性根尖周炎的病因與糞腸球菌有關[1]尤其在臨床癥狀明顯的情況下。咬合痛的病例組與瘺道的病例組中中糞腸球菌的檢出率明顯高于其它癥狀表明糞腸球菌的檢出，說明咬合痛與瘺道的病例中與糞腸球菌的存在有明顯關系，與臨床癥狀中的咬合痛密切相關。有臨床癥狀與無臨床癥狀的糞腸球菌檢出率無統(tǒng)計學差異，但在咬合痛與非咬合痛的病例中糞腸球菌的檢出率有顯著性差異，提示糞腸球菌可能是導致咬合痛的主要病原菌[2]。

有臨床癥狀且有根尖周明顯破壞的病例較無臨床癥狀無根尖周破壞的病例糞腸球菌檢出率高，有根尖周破壞的病例與無根尖周破壞的病例中糞腸球菌的檢出率存在顯著性差異。表明再治療根管內(nèi)糞糞球菌的檢出率與根尖周破壞呈正相關，而在根尖周破壞的情況下，有癥狀的病例較無癥狀的病例糞腸球菌檢出率高。相關文獻[3]分析急性根尖周炎根管內(nèi)細菌，為藥敏試驗奠定基礎。認為感染根管內(nèi)的優(yōu)勢厭氧菌主要為類桿菌、梭桿菌、真細菌、丙酸桿菌、放線菌和消化鏈球菌等。

郭惠杰[4]等對慢性根尖周炎患牙根尖外表面的生物膜進行細菌學研究和形態(tài)學觀察，了解生物膜中細菌的種類、組成及其超微結(jié)構(gòu)。。認為慢性根尖周炎患牙的根尖外表面存在細菌生物膜結(jié)構(gòu)，該生物膜的存在與臨床上難治性慢性根尖周炎密切相關。孫慧斌等[5]通過對根管治療失敗病例根管內(nèi)微生物進行分子生物學檢測，研究失敗病例根管內(nèi)各種細菌的檢出率及優(yōu)勢菌；分析臨床癥狀和體征與特殊微生物的關系。選擇PCR檢測鑒定。根管治療失敗病例根管主要呈混合感染，共檢出6種細菌，糞腸球菌是最常檢出的細菌，產(chǎn)黑普氏菌與疼痛、衣氏放線菌與瘺道有一定的相關性。認為根管治療失敗的主要原因是根管內(nèi)的微生物感染持續(xù)存在，根管治療失敗病例根管內(nèi)微生物組成有其特殊性。初步分析：難治性根尖周炎的病因仍為細菌感染，是多細菌感染，糞腸細菌是最常提出的細菌。

[1] Siren EK,Haapasalo MP,Ranta K,et al.Microbiological findings and clinical treatment procedures in endodontic cases selected for microbiological investigation[J].Int Endod J,1997,30(2):91-95.

[2] Gomes BP,Pinheiro ET ,Sousa EL,et al.Enterococcus faecalis in dental root canals detected by culture and by polymerase chain reaction analysis[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod ,2006,102(2):247-253.

[3] 盧川.急性根尖周炎患牙根管內(nèi)厭氧菌的初步分析[J].廣東牙病防治，2002，10(1)：45-46.

[4] 郭惠杰.慢性根尖周炎患牙根尖外表面的細菌生物膜[J].北京大學學報·醫(yī)學版，2009，41(5)： 571-574.

[5] 孫慧斌.根管治療失敗病例根管內(nèi)微生物的分子生物學檢測[J].實用口腔醫(yī)學雜志，2010，1：96-99.