先兆子癇患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-9表達(dá)及侵襲性研究

孫新六 劉秀蘭 紹春月

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

先兆子癇是產(chǎn)前嚴(yán)重并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為高血壓、蛋白尿和腦功能障礙[1]。預(yù)防先兆子癇的發(fā)生是婦產(chǎn)臨床至關(guān)重要。此研究探討胎盤基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase -9,MMP-9)與先兆子癇發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1臨床資料 病例是2010年3月至2013年1月在本院就診，均為首胎，其中先兆子癇患者32例，均齡28.6+7.2，另30例正常孕婦為對照，均齡27.3+ 6.5。孕期12周抽取外周血，凝固分離血清，-80℃保存，分娩后立即摘取胎盤絨毛膜組織，保存于-80℃。

1.2試劑 TRIzoL提取液，購于Invitrogen公司； 逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購于TaKARa公司; Matrigel、Millicellchamber購于美國BD公司。

1.3先兆子癇病例篩選標(biāo)準(zhǔn)：血壓>160/110 mmHg,尿蛋白>2.0g/24h,肝酶ACT或AST上升，并呈現(xiàn)腦障礙癥狀。

1.4總RNA提取 剪取約50mg胎盤絨毛膜組織，生理鹽水充分漂洗，TRIzoL液低溫勻漿，轉(zhuǎn)入EP管中，充分裂解細(xì)胞，氯仿沉淀蛋白，異丙醇沉淀RNA，乙醇漂洗后，短暫干燥以無菌水充分溶解RNA，確保OD260/280=1.8～2.0，凝膠電泳顯示RNA完整，將RNA液調(diào)至1.0 μg/μl。

1.5MMP-9 mRNA檢測 引物設(shè)計(jì)，以Primer 5軟件設(shè)計(jì)，同時(shí)在NCBI 上BLAST其特異性。

上游引物： 5‘-CCGCAGGGCCCCTTCCTTAT-3’

下游引物： 5’-GCCCACTTGGTCCACCTGGTT-3’

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(10 μl體系): 含逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo dT,dNTP混合物,RNA底物1 μg,42 ℃反應(yīng)30 min,95 ℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系20?l):取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，加入PCR反應(yīng)混合液，反應(yīng)程序(30個(gè)循環(huán))：94 ℃, 40 s變性，60 ℃,40 s復(fù)性，72 ℃1min延伸。最后72 ℃充分延伸10 min,同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參照基因β-actin。2%瓊脂糖凝膠電泳，Alpha圖像分析儀拍照，進(jìn)行半定量分析。

1.6外周血MMP-9蛋白檢測 采用夾心法ELISA法，微孔板包埋有抗MMP-9抗體，與血清中MMP-9蛋白結(jié)合后，加入酶標(biāo)記的抗MMP-9二抗，最后加入反應(yīng)底物顯色，測OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品測定值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各樣品MMP-9含量。

1.7侵襲性試驗(yàn)

1.7.1分離滋養(yǎng)細(xì)胞: 分三組: 先兆子癇組32例,正常孕婦組30例,早期引產(chǎn)組10例(均胎齡3.2月)。產(chǎn)出或引產(chǎn)的胎盤, 立郎無菌剪取一小塊,分離剪下絨毛膜滋養(yǎng)層,在含500 U/ml膠原酶、200 U/ml透明質(zhì)酸酶和0.2 mg/ml DNA酶PBS液中37 ℃ 消化20 min。離心棄上清，加入含0.25%胰蛋白酶、2 nM EDTA、0.2 mg/L 消化20 min后，轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞分離液上層，2000轉(zhuǎn)/min離心15min,收集細(xì)膜層，以PBS漂洗數(shù)次。細(xì)胞與磁珠標(biāo)次的CD-45抗體混合，在磁分離儀作用下除去CD-45陽性細(xì)胞，余下細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞。

1.7.2侵襲實(shí)驗(yàn) 吸取人工基底膜液Matrigel 50 μl均勻涂布在Millicell 小室膜上,成膠30 min ,紫外線下照射過夜.分三組分別取先兆子癇組、正常對照組，正常早期胎盤組分離純化的滋養(yǎng)細(xì)胞2×105個(gè)接種到成膠的Millicell 小室中, 并將Millicell 小室置于培養(yǎng)孔板內(nèi)。培養(yǎng)30 min,棄去未吸附的細(xì)胞，換上新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h ，取出Millicell 小室 ,擦去Matrigel膠層,PBS 液漂洗數(shù)次,3%甲醛固定20 min ，PBS液漂洗。 加入抗人胎盤催乳素(HPL)抗體，4 ℃過夜，加過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，最后加反應(yīng)底物DAB顯色。取下Millicell chamber 膜貼在載玻片上，觀察侵襲的滋養(yǎng)細(xì)胞，在光鏡下( ×20) 每個(gè)膜分別計(jì)數(shù)5 個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù),計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SSPS 12.0軟件分析,MMP-9相對表達(dá)率進(jìn)行t檢驗(yàn),滋養(yǎng)層細(xì)胞穿透實(shí)驗(yàn)三組進(jìn)行方差分析,數(shù)據(jù)以mean±SD 表示，均以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1MMP-9 mRNA表達(dá) 擴(kuò)增出的 MMP-9 為 196bp(圖1)

先兆子癇組MMP-9相對β-actin表達(dá)率為0.23+0.06 ，正常對照組MMP-9相對β-actin表達(dá)率0.52+ 0.12。先兆子癇組MMP-9表達(dá)率減少，經(jīng)t檢驗(yàn)兩組差異顯著(P<0.05)

圖1 MMP-9 mRNA表達(dá),M:標(biāo)準(zhǔn)分子量;1、2：先兆子癇組；3、4：正常對照組。

2.2血清MMP-9蛋白濃度 先兆子癇組血清中MMP-9濃度為102.4+ 27.2 ng/ml, 而正常組血清中MMP-9為287.4+ 46.2 ng/ml, 經(jīng)t檢驗(yàn)兩者差異顯著(P<0.01).

表1 外周血MMP-9濃度

*P< 0.01,與正常組比較差異顯著

2.3滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲 各組滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲見表2,先兆子癇患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降(透膜細(xì)胞數(shù)24.2 + 5.6),與正常孕婦滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力(透膜細(xì)胞數(shù)102.6+ 14.3)比較差異顯著(P<0.01);與正常孕婦晚期胎盤比較,早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力強(qiáng)(透膜細(xì)胞數(shù)187.4+21.2),兩者顯著(P<0.01)。

表2 胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

*與正常孕婦組比較,P<0.01

3 討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)功能是降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原和明膠,促進(jìn)血管生成及增強(qiáng)上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[2]。研究表明，多種腫瘤細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶9，降解基底膜和IV型膠原，促進(jìn)腫瘤的侵襲和惡變[3]。胎盤形成中，絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)壁進(jìn)行侵襲, 滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入母體螺旋動(dòng)脈,破壞血管基底層,將這些血管變成高容量血道,從而增進(jìn)母血的輸送[4]。先兆子癇及產(chǎn)小體嬰兒歸因于滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力弱從而胎盤形成不良。

基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)降低，使基底膜中膠原降解減弱，絨毛膜滋養(yǎng)層侵襲淺，胎盤在子宮內(nèi)壁著床不良，使胎兒供血不良，易誘發(fā)先兆子癇及流產(chǎn)[5]。

本實(shí)驗(yàn)中先兆子癇患者組滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP-9 mRNA和外周血MMP-9蛋白相對正常孕婦表達(dá)均下降，顯示MMP-9表達(dá)與先兆子癇存在相關(guān)性。早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲強(qiáng)，隨著孕程的進(jìn)展，胎盤的成熟，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力逐漸減弱，與之相應(yīng)的，MMP-9的表達(dá)也逐漸下降，早期胎盤MMP-9表達(dá)比晚期胎盤表達(dá)強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)為臨床監(jiān)控先兆子癇的發(fā)生提供了一個(gè)指標(biāo)，檢測外周血MMP-9水平可評估臨床先兆子癇發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性。

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