急性重癥胰腺炎臟器損傷及病理學(xué)基礎(chǔ)研究

李苗苗 李金鑫 王曉曄

(天津市兒童醫(yī)院微創(chuàng)外科，天津 300074)

急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)在近幾年來(lái)發(fā)生率越來(lái)越高，發(fā)病過(guò)程中除胰腺出血壞死外可并發(fā)肺臟、腎臟、肝臟、腸管、心臟等臟器功能障礙[1]。如休克、ARDS、ARF、敗血癥、肺炎、糖尿病、血栓性靜脈炎及DIC等，病死率極高，常合并多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，目前MODS公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制有：1.微循環(huán)障礙2.組織細(xì)胞代謝障礙3.細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)過(guò)度釋放4.腸道細(xì)菌與內(nèi)毒素異位。SAP引起的MODS發(fā)病機(jī)制有其獨(dú)特的特點(diǎn)：由于胰腺自身的消化造成的胰腺損傷，導(dǎo)致各種胰酶入血并相繼激活，其中其主要作用的胰酶有：胰蛋白酶[2]、磷脂酶A2、激肽釋放酶、彈性蛋白酶和脂肪酶，上述胰酶入血首先接觸并消化的是全身各器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管通透性增加，隨即胰酶通過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)入各器官，引起各器官的損傷并進(jìn)一步引起各種炎癥反應(yīng)[3]，由此可見(jiàn)，SAP引發(fā)MODS的發(fā)病機(jī)制中胰酶對(duì)血管內(nèi)皮的損傷是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)用經(jīng)十二指腸進(jìn)入胰膽管逆行注射?；悄懰徕c方法制作急性重癥胰腺炎模型，通過(guò)血清生化學(xué)檢測(cè)及病理學(xué)證實(shí)SAP發(fā)病過(guò)程中各主要臟器血的損傷，通過(guò)流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)觀察SAP大鼠不同時(shí)間點(diǎn)靜脈血脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞的相對(duì)數(shù)變化，探討SAP導(dǎo)致MODS時(shí)血管內(nèi)皮損傷的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

將90只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為2組：假手術(shù)(SO)組、模型(SAP)組，每組45只。每組隨機(jī)分為3h組、6h組、12h組3個(gè)時(shí)間組，每時(shí)間組15只,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死相應(yīng)時(shí)間組大鼠并收集標(biāo)本。

1.2 急性重癥胰腺炎大鼠模型的制備方法

術(shù)前大鼠禁食12 h， SAP組用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠[4]，行上腹部劍突下正中切口(1～2 cm)、進(jìn)腹，提起十二指腸，辨認(rèn)胰膽管及肝門(mén)部膽總管，用動(dòng)脈夾夾閉膽總管近肝門(mén)處，于十二指腸降部找到胰膽管開(kāi)口，用靜脈留置針在對(duì)側(cè)腸壁上選一無(wú)血管區(qū)進(jìn)針，找到并進(jìn)入十二指腸大乳頭，緩慢推進(jìn)4～5 mm，確定針頭在胰膽管內(nèi)后，拔出針芯，輕壓十二指腸大乳頭，注入5%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g，0.2 ml/min)[5]，注射完畢后用手壓迫進(jìn)針處3 min，可見(jiàn)胰腺充血、水腫。去除動(dòng)脈夾，將腸管復(fù)位，分層關(guān)腹。SO組僅找到十二指腸及胰腺翻動(dòng)幾次后關(guān)腹。實(shí)驗(yàn)大鼠手術(shù)后均禁食禁飲，背部皮下注射生理鹽水補(bǔ)液(40 ml/kg體重)[6]。

1.3 觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率

觀察兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神狀況、呼吸狀況、死亡時(shí)間、死亡數(shù)量，觀察12 h。

1.4 血清淀粉酶、白蛋白、肝腎功能及靜脈血脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞的測(cè)定

兩組于造模成功后3 h、6 h、12 h各取相應(yīng)組大鼠，用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，股靜脈取血2～3 ml，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清淀粉酶、白蛋白及肝腎功能；取血1 ml置于EDTA抗凝管中用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。

1.5 各器官病變觀察及組織病理學(xué)觀察評(píng)分

兩組于造模成功后3 h、6 h、12 h各取相應(yīng)組大鼠，解剖并剪取相同部位的胰腺、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、小腸、胸主動(dòng)脈組織，分別放入盛有10 福爾馬林的小瓶中固定，做石蠟切片，每例均進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。倒置顯微鏡下觀察，拍照。分別用低倍鏡(100倍)和高倍鏡(200倍)觀察，每個(gè)器官取2張切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野。胰腺病理學(xué)評(píng)分參照Schmidt[7]評(píng)分。

1.6 病理組織HE染色

每組動(dòng)物模型術(shù)后組織取材用10%福爾馬林固定，修剪病理組織后于脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，在切片機(jī)上常規(guī)切片，89℃烤箱過(guò)夜后常溫保存。行HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后狀態(tài)與存活率觀察結(jié)果

SAP組大鼠蘇醒后，呈腹部屈曲體位，豎毛，精神差，活動(dòng)差。SP組大鼠蘇醒后，呈腹部屈曲體位，無(wú)異?；顒?dòng)。SO大鼠術(shù)后12h無(wú)一死亡，生存率100%，SAP組大鼠死亡10只(3h組死亡2只，6h組死亡3只，12h組死亡5只)，存活率78%。SAP組存活率明顯低于SO組，P<0.01。

2.2 血清淀粉酶測(cè)定結(jié)果

SAP組大鼠術(shù)后3h、6h、12h血清淀粉酶水平均高于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。 SAP組血淀粉酶水平在術(shù)后出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。

肝腎功能選取AST、ALT、BUN、Cre為觀察指標(biāo)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2～5。SAP組大鼠與SO組相比, 各時(shí)間點(diǎn)AST、ALT、BUN、Cre水平均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨病程延長(zhǎng)，SAP組大鼠AST、ALT、BUN、Cre水平逐漸增高。

2.3 兩組大鼠靜脈血脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)

SAP組大鼠術(shù)后3h、6h、12h靜脈血血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)數(shù)與SO組對(duì)比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表7。

表1 兩組大鼠血清淀粉酶水平

表2 兩組大鼠血清AST水平

注：各時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠AST水平比較P<0.01。

表3 兩組大鼠血清ALT水平

注：各時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠ALT水平比較P<0.01。

表4 兩組大鼠血清BUN水平

注：各時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠BUN水平比較P<0.01 。

表5 兩組大鼠血清Cre水平

注：各時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠Cre水平比較P<0.01。

表6 兩組大鼠血清白蛋白水平

與SO組比較，*P<0.05，#P>0.05

表7 兩組大鼠脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)

注：各時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠Cre水平比較P<0.01

2.4 脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞與血清淀粉酶的相關(guān)性及回歸分析

將SAP組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)數(shù)與血清淀粉酶的水平分別作為x變量和y變量，繪制散點(diǎn)圖，隨著脫落VEC的增加，AMY水平逐漸增加，兩者之間有明顯的正相關(guān)，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件Spearman相關(guān)分析的相關(guān)系數(shù)r=0.849，P<0.01, 如圖1散點(diǎn)圖所示。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行直線回歸分析得直線回歸方程Y=5.495+0.006x, F=87.9，P<0.01。

圖1 SAP組各時(shí)間點(diǎn)脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與AMY散點(diǎn)圖

2.5 脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞與胰腺病理評(píng)分的相關(guān)性及回歸分析

將SAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺病理Schmidt評(píng)分與脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)分別作為x變量和y變量，繪制散點(diǎn)圖，兩者之間有明顯的正相關(guān)，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件Spearman相關(guān)分析的相關(guān)系數(shù)r=0.842,P<0.01，散點(diǎn)圖如圖2所示。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行直線回歸分析得直線回歸方程Y=21.227+4.837x, F=82.843，P<0.01。

圖2 SAP組大鼠各時(shí)間點(diǎn)胰腺病理評(píng)分與脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)散點(diǎn)圖

2.6 各器官病理組織學(xué)觀察

2.6.1胰腺及各主要臟器大體外觀觀察

SO組:腹腔內(nèi)有少許淡黃色腹水，余臟器未見(jiàn)肉眼可辨病理改變。SAP組:模型誘導(dǎo)后5分鐘胰腺呈現(xiàn)廣泛被膜下出血水腫以胰腺體尾部為明顯;3小時(shí)后胰腺組織輪廓消失，呈粘凍狀的出血壞死改變，腹水呈淡紅色，6、12小時(shí)組胰腺組織廣泛出血壞死，范圍擴(kuò)大，胰腺周?chē)缶W(wǎng)膜及腹膜有較多皂化斑點(diǎn)，腹腔內(nèi)大量血性腹水。肝臟組織3小時(shí)呈明顯淤血水腫改變，6、12小時(shí)肝臟色澤蒼白渾濁，部分大鼠肝臟邊緣可見(jiàn)散在不規(guī)則灰色斑塊及壞死表現(xiàn)。腎臟早期變化不明顯，6、12小時(shí)段呈明顯腫脹，部分大鼠腎包膜表面有散在出血點(diǎn)，腎周脂肪皂化。肺臟早期呈充血水腫，后期肺臟組織呈淡紅色，部分可見(jiàn)較多散在出血點(diǎn)，胸腔內(nèi)有淡黃色或血性胸水。

2.6.2胰腺及各主要臟器鏡下病理觀察

模型組：胰腺:細(xì)胞腫脹、細(xì)胞器崩解以及蛋白質(zhì)變性是細(xì)胞壞死的基本表現(xiàn)，而細(xì)胞核的固縮、碎裂、溶解又是典型表現(xiàn)，間質(zhì)小血管壁壞死，胰腺間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，灶狀或片狀細(xì)胞壞死，呈現(xiàn)核固縮、破碎,胞質(zhì)疏松、淡染，細(xì)胞界限不清，病變嚴(yán)重程度隨造模后時(shí)間延長(zhǎng)而加重。

肺臟：可見(jiàn)肺間質(zhì)及肺泡腔水腫，肺小血管周?chē)梢?jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血;6、12小時(shí)組支氣管周?chē)^多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔部分融合成肺大泡,部分萎縮，毛細(xì)血管壞死，肺泡壁可見(jiàn)散在紅細(xì)胞。

肝臟：3小時(shí)組多數(shù)以肝臟細(xì)胞充血水腫伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，后期可見(jiàn)局灶性或不規(guī)則片狀出血壞死，部分為凝固性壞死，肝竇及匯管區(qū)周?chē)罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)及散在紅細(xì)胞。腎臟：可見(jiàn)腎小球毛細(xì)血管淤血，腎小管上皮細(xì)胞散在壞死及間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);6、12小時(shí)組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死面積逐漸擴(kuò)大，腎小囊內(nèi)出現(xiàn)嗜伊紅染色絮狀物和紅細(xì)胞，腎小管內(nèi)可見(jiàn)均質(zhì)管形和紅細(xì)胞管型，小部分出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞片狀壞死。

小腸：可以看到腸黏膜充血水腫、間質(zhì)水腫伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腸絨毛部分腸黏膜上皮細(xì)胞變性壞死、脫落,黏膜出血。主動(dòng)脈：可見(jiàn)平滑肌間質(zhì)水腫，細(xì)胞腫脹，排列紊亂，肌纖維管腔面血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性減低。

心臟：心肌細(xì)胞腫脹,排列紊亂,點(diǎn)片狀壞死,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),心肌纖維呈局灶性嗜酸變性及壞死,橫紋肌模糊或消失,縱行肌纖維斷裂,病變心肌呈帶狀或灶性分布,心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張瘀血,血竇擴(kuò)張。

SAP組大鼠各器官病理切片的共同特點(diǎn)為：血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死、脫落，血管壁破裂、出血，血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)，各組織細(xì)胞溶解壞死，組織結(jié)構(gòu)紊亂。

假手術(shù)組:除部分胰腺腺泡細(xì)胞水腫及肺臟支氣管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)外其余臟器細(xì)胞未見(jiàn)異常改變。

2.6.3兩組大鼠胰腺病理Schmidt 評(píng)分

SAP組大鼠術(shù)后3h、6h、12h胰腺病理評(píng)分與SO組大鼠相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。見(jiàn)表8。

表 8 兩組大鼠胰腺病理Schmidt 評(píng)分

注：各時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠病理評(píng)分比較P<0.01

3 結(jié) 論

SAP大鼠各組織器官存在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并出現(xiàn)外周血脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞增多。脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量與胰腺病理?yè)p傷及淀粉酶水平呈正相關(guān)。

SAP時(shí)胰蛋白酶入血，首先損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，并使血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，血管通透性增加，導(dǎo)致胰酶透過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)入組織，引起細(xì)胞溶解壞死并引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成多器官功能障礙綜合征。因此脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞增多是預(yù)測(cè)早期MODS的可靠指標(biāo)之一。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于急性重癥胰腺炎的治療主要有以下幾方面：(1)抑制胰液分泌，主要藥物有生長(zhǎng)抑素、奧曲肽；(2)抑制胰酶活性，主要藥物有烏司他丁、加貝脂、抑肽酶等；(3)抑制胃酸分泌，主要為H2受體拮抗劑和H+-K+-ATP酶抑制劑；4.應(yīng)用抗菌藥物預(yù)防感染；5.改善微循環(huán)及營(yíng)養(yǎng)支持；6.血液透析治療[8]；7.手術(shù)引流胰周壞死組織，減少壞死物質(zhì)吸收[9]。但在臨床實(shí)踐中，首診SAP患者往往已經(jīng)進(jìn)入MODS早期，即激活的胰蛋白酶已經(jīng)進(jìn)入血液循環(huán)并損傷血管內(nèi)皮屏障，此時(shí)，上述治療方案中用于抑制胰酶分泌的措施不能終止已釋放入血的胰酶對(duì)組織的損傷，同時(shí)血液透析及抑制炎癥反應(yīng)藥物只能抑制炎癥反應(yīng)的"瀑布樣反應(yīng)"[10,11]，不能從根本上抑制胰酶對(duì)各組織器官的進(jìn)一步損傷。手術(shù)治療也只是起到引流壞死物質(zhì)，減少炎癥物質(zhì)吸收的作用[12,13]。因此，在SAP治療過(guò)程中，需要進(jìn)一步探討出新的藥物能拮抗胰蛋白酶對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，從而達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞更好治療急性重癥胰腺炎。

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