牛蒡子苷元對高糖刺激大鼠系膜細胞轉(zhuǎn)化生長因子β1表達的影響*

趙 輝 袁 莉 賈 莉 王衛(wèi)華 李 琳

(菏澤醫(yī)學?？茖W校，山東 菏澤 274000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最嚴重的微血管并發(fā)癥和致死原因。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)在DN以及腎小球硬化癥的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。在DN的發(fā)病過程中，TGF-β1可引起腎小球系膜基質(zhì)增厚以及腎小球基底膜增厚，是導致DM患者腎小球硬化的主要因素[2]。近年來研究表明牛蒡子具有降血糖活性，牛蒡子主要成分為牛蒡子苷(ARC)、牛蒡子苷元(ARC-G)等，其中起降血糖作用的主要活性成分為ARC-G[3-4]。前期研究顯示ARC-G可以減輕糖尿病大鼠腎損害，而對腎臟系膜細胞(GMCs)的影響卻沒有報道。本研究初步觀察ARC-G對高糖刺激GMCs TGF-β1表達的影響，為更好的開發(fā)利用牛蒡子的藥用價值提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 GMCs，武漢大學中國典型細胞培養(yǎng)物保藏中心；RPMI 1640，GIBCO公司； RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒，上海生物工程有限公司；引物，上海博尚。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將GMCs接種于RPM I-1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U /ml鏈霉素)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代后，取生長對數(shù)期細胞用于實驗。

1.2.2GMCs中TGF-β1 mRNA表達檢測 取對數(shù)生長期GMCs，消化后按1×106/ml/孔接種于6孔板，分為：正常對照組(10%FCS, 含葡萄糖5.4 mmol/L)、高糖組(10%FCS, 含葡萄糖30.0 mmol/L)、ARC-G組(3 μmol/L 、30 μmol/L)，用藥組均用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞干預48 h后，收集細胞，按照試劑盒提取細胞總RNA，并測定總RNA含量。按逆轉(zhuǎn)錄反應體系10 μl中加RNA 0.5 μg計算，取RNA 0.5 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，用實時定量PCR的方法進行PCR擴增。TGF-β1：上游引物5’-GCCTGTGTGGCTGTCTTTTGA-3’，下游引物5’-GAAGCGAAAGCCTTGTATTCC-3’，產(chǎn)物243 bp；GAPDH：上游引物5’-TCCTAGCACCATGAAGATG-3’，下游引物5’-AAACGCAGCTCAGTAACAC -3’，產(chǎn)物180 bp。采用實時熒光定量PCR定量分析方法處理各組目的基因mRNA的相對表達量?！鳌鰿t= [Ct(實驗組基因)- CtGAPDH(實驗組基因)]- [Ct(對照組基因)- CtGAPDH(對照組基因)]。

2 結(jié) 果

結(jié)果見表1。與對照組比較，高糖刺激后，GMCs TGF-β1 mRNA的表達增加(P<0.05)，經(jīng)ARC-G作用后，TGF-β1 mRNA的表達下降(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

表1 各組GMCs TGF-β1 mRNA水平比較

組別濃度(μmol/L)TGF-β1正常組-1.00±0.00高糖組-1.33±0.07*ARC-G組31.01±0.08300.90±0.04#

注：與對照組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P< 0.05。

3 討 論

DN是DM最嚴重的微血管并發(fā)癥和致死原因。它主要以蛋白尿及進行性腎功能不全為臨床特點。DN發(fā)病機制極為復雜，早期表現(xiàn)為腎小球內(nèi)高血壓、高灌注、高濾過，進而出現(xiàn)腎小球毛細血管基底膜增厚和系膜基質(zhì)增多，最終發(fā)展為腎小球硬化[5]。GMCs是腎小球中功能最活躍的細胞，具有許多功能，在腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展中處于重要地位。正常情況下，GMCs不增殖，但在多種因素作用下，GMCs可發(fā)生異常增殖，同時伴有系膜基質(zhì)增多，最終發(fā)展為腎小球硬化[6-7]。

在DN發(fā)病過程中， TGF-β1等細胞因子起著非常重要的作用。TGF-β1屬于TGF-β超家族，是由兩條二硫鍵組成的二聚體，是一種由許多細胞分泌的具有許多生物學活性的多肽生長因子，廣泛存在于各種正?；虿∽兘M織中，參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程[8]。TGF-β1在腎臟表達廣泛，是最主要的促纖維化生長因子。TGF-β1以旁分泌和自分泌的方式刺激成纖維細胞、腎小管上皮細胞、GMCs等腎臟固有細胞活化增殖，分泌大量Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白(FN)、層粘蛋白(LN)等細胞外基質(zhì)(ECM)成分，以及基質(zhì)蛋白降解酶的抑制物。TGF-β1既可以促進ECM成分沉積，又可以抑制其降解。因此，TGF-β1已被公認為導致ECM積聚的重要生長因子，與腎小球硬化密切相關(guān)[9]。

牛蒡子是從菊科(Compositae)兩年生草本植物牛蒡?qū)倥］?Arctium lappa L.)的干燥成熟果實牛蒡子中提取分離而來的木脂素化合物，牛蒡葉中也有少量存在。牛蒡子苷元(arctigenin，ARC-G)為牛蒡子分解后的產(chǎn)物，此外尚有牛蒡子酚A、B、C、D、E、F、H、羅漢松酯素以及數(shù)十種2，3-二芐基丁內(nèi)酯木脂素等[10]?，F(xiàn)代藥理學證明牛蒡子具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、降血糖等多重功效。本研究顯示，高糖刺激后，GMCs TGF-β1 mRNA的表達增加；經(jīng)ARC-G干預后，TGF-β1 mRNA的表達下降。其中的機制可能為ARG通過抑制TGF-β1的表達，發(fā)揮其腎臟保護作用。

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