SLC17A8基因與聽(tīng)神經(jīng)病*

齊悅 綜述 王秋菊 審校

聽(tīng)神經(jīng)病是一種內(nèi)毛細(xì)胞和聽(tīng)神經(jīng)突觸和/或聽(tīng)神經(jīng)本身功能不良所致的聽(tīng)力障礙，是導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽(tīng)力障礙的重要疾病之一，其主要的聽(tīng)力學(xué)特征包括言語(yǔ)識(shí)別率與純音聽(tīng)力不成比例的明顯下降，誘發(fā)性耳聲發(fā)射(EOAE)和/或耳蝸微音器電位(CM)正常，而耳聲發(fā)射對(duì)側(cè)聲抑制效應(yīng)消失，聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)缺失或嚴(yán)重異常，中耳鐙骨肌聲反射引不出或閾值明顯升高等[1]。

聽(tīng)神經(jīng)病病因復(fù)雜，大體上可分為環(huán)境因素和遺傳因素。相關(guān)的環(huán)境因素包括新生兒高膽紅素血癥、營(yíng)養(yǎng)代謝障礙、自身免疫、缺氧等。近些年來(lái)，隨著遺傳學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一系列聽(tīng)神經(jīng)病相關(guān)基因，其中，與非綜合征型聽(tīng)神經(jīng)病相關(guān)的基因有OTOF[2]、 PJVK[3]、DIAPH3[4]和12S rRNA (T1095C)[5]，與綜合征型聽(tīng)神經(jīng)病相關(guān)的基因有PMP22[6]、MPZ[7]、NF-L[8]、NDRG1[9]、GJB1[10]、 GJB3[11]、OPA1[12]、TMEM126A[13]、FXN[14]、TIMM8A[15]、WFS1[16]和MTND 4 (11778mtDNA)[17]，此外還定位了和聽(tīng)神經(jīng)病相關(guān)的基因座位AUNX1[18]。這些基因選擇性地?fù)p傷聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路的不同部位，導(dǎo)致相應(yīng)的臨床表型，提示遺傳因素在聽(tīng)神經(jīng)病發(fā)病中起著重要作用。根據(jù)損傷部位不同，聽(tīng)神經(jīng)病可分為：①聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)病變型(突觸后型)；②聽(tīng)覺(jué)突觸病變型(突觸及突觸前型)；③非特異型聽(tīng)神經(jīng)病變[19]。

SLC17A8基因編碼的囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(vesicular glutamate transporter 3，VGLUT3)和第一個(gè)確診的非綜合征型聽(tīng)神經(jīng)病致病基因OTOF[2]編碼的Otoferlin 蛋白均作用于突觸前，調(diào)節(jié)內(nèi)毛細(xì)胞谷氨酸的傳遞，基因突變導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)系統(tǒng)谷氨酸傳遞障礙而致病。此外，研究發(fā)現(xiàn)SLC17A8基因缺陷動(dòng)物模型的臨床表現(xiàn)型與聽(tīng)神經(jīng)病十分相似[20]。因此， SLC17A8基因與聽(tīng)神經(jīng)病的發(fā)病聯(lián)系密切，可能是聽(tīng)神經(jīng)病的致病基因之一。

1 SLC17A8基因的結(jié)構(gòu)

SLC17A8基因于2002年被首次克隆并命名[21]，基因全長(zhǎng)80 kb，定位在染色體12q23.1區(qū)域，共有12個(gè)外顯子。 SLC17A8基因突變可引起DFNA25耳聾。Greene等[22]將DFNA25基因座定位在染色體12q21-q24.5上，在這段長(zhǎng)達(dá)14.3 Mb的DNA序列里，包括了60多個(gè)基因，而SLC17A8基因就是其中之一。

SLC17A8基因編碼的蛋白質(zhì)是囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(VGLUT3)。VGLUT3蛋白全長(zhǎng)589個(gè)氨基酸，包含10個(gè)TM結(jié)構(gòu)域，8個(gè)跨膜片段和一個(gè)長(zhǎng)的C末端。VGLUT3蛋白屬于溶質(zhì)載體家族17，是該家族第8個(gè)成員，目前已發(fā)現(xiàn)了VGLUT的3個(gè)亞型(VGLUT1、VGLUT2、VGLUT3)，VGLUT3與VGLUT1有72.5% 的同源性，并與VGLUT2有 72%的同源性。VGLUT3外顯子5和6編碼的氨基酸具有高度保守性[20]，人類與褐家鼠、線蟲(chóng)、黑腹果蠅的同源核酸及蛋白質(zhì)序列進(jìn)化分析一致。

2 SLC17A8基因的表達(dá)分布與功能研究

Fremeau等[23]對(duì)小鼠進(jìn)行免疫組織熒光分析，發(fā)現(xiàn)VGLUT3蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，海馬、齒狀回、大腦新皮質(zhì)、紋狀體的膽堿能神經(jīng)元、5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)元以及GABA能神經(jīng)元中均有VGLUT3蛋白分布。同時(shí)，F(xiàn)remeau等還對(duì)VGLUT3進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究，發(fā)現(xiàn)VGLUT3標(biāo)記在胞漿囊泡，而非定位在細(xì)胞核。董玉琳等[24]在大鼠脊髓部分星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了VGLUT3的表達(dá)。王遠(yuǎn)等[25]通過(guò)抗生素蛋白-生物素化的過(guò)氧化酶復(fù)合方式，以二氨基聯(lián)苯胺作為染色劑，用免疫組織化學(xué)染色方法分析正常成年SD大鼠VGLUT3蛋白在前庭外周系統(tǒng)中的分布特征，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞免疫染色的強(qiáng)度明顯不同：囊斑、壺腹嵴感覺(jué)上皮細(xì)胞、毛細(xì)胞的VGLUT3免疫反應(yīng)為強(qiáng)陽(yáng)性，囊斑、壺腹嵴傳入神經(jīng)纖維則呈現(xiàn)為VGLUT3弱陽(yáng)性。免疫物質(zhì)均局限于細(xì)胞漿，而在細(xì)胞核中缺乏，這一亞細(xì)胞定位與Fremeau等[23]在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)類似。Obholzer等[26]研究表明， VGLUT3蛋白在斑馬魚(yú)側(cè)線器官和內(nèi)耳毛細(xì)胞特異表達(dá)。此外，VGLUT3蛋白在嚙齒類動(dòng)物和人類視網(wǎng)膜無(wú)軸突細(xì)胞、小鼠的肝臟、腎臟也有表達(dá)[27，28]。

為了研究VGLUT3蛋白在活體內(nèi)的功能，Seal等[29]首次克隆了SLC17A8基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)VGLUT3蛋白缺失的小鼠表現(xiàn)為極重度聾。VGLUT3蛋白在毛細(xì)胞谷氨酸釋放中有著重要的起動(dòng)作用，由于VGLUT3蛋白的缺陷，毛細(xì)胞缺少谷氨酸釋放，使SLC17A8基因敲除小鼠部分耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)在早期即出現(xiàn)了退化。此外，SLC17A8 基因敲除小鼠還可出現(xiàn)癲癇，伴顯著的行為改變。由此推論VGLUT3表達(dá)引起谷氨酸的釋放，不僅在聽(tīng)覺(jué)通路發(fā)揮必不可少的功能，也在發(fā)育以及控制皮層興奮性中起著重要的作用。

Ruel等[20]敲除了小鼠SLC17A8基因外顯子2，導(dǎo)致基因復(fù)制終止，從而使等位基因的功能完全喪失。該研究發(fā)現(xiàn)SLC17A8外顯子2定向缺失的小鼠缺乏對(duì)聲刺激的聽(tīng)神經(jīng)反應(yīng)，小鼠2周大時(shí)，膜電容測(cè)量表明，SLC17A8基因突變小鼠Ca2+誘發(fā)的突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)正常，SLC17A8缺失不會(huì)造成內(nèi)毛細(xì)胞傳入突觸主要結(jié)構(gòu)的變化。掃描電鏡觀察顯示，SLC17A8基因敲除小鼠有完整的毛細(xì)胞，內(nèi)外毛細(xì)胞的靜纖毛形狀正常，除了耳蝸有一些散在的內(nèi)毛細(xì)胞缺失(不到內(nèi)毛細(xì)胞的總數(shù)的1%)，內(nèi)毛細(xì)胞在數(shù)量上并無(wú)明顯改變。但是，在SLC17A8基因敲除小鼠的內(nèi)毛細(xì)胞傳入神經(jīng)元，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。由此推斷，在谷氨酸釋放到聽(tīng)神經(jīng)末梢受體之前，VGLUT3在感覺(jué)性內(nèi)毛細(xì)胞的突觸囊泡積累谷氨酸，SLC17A8缺陷小鼠的耳聾由囊泡攝取和釋放谷氨酸的特異性缺陷造成，在內(nèi)毛細(xì)胞突觸中，VGLUT3 對(duì)聽(tīng)覺(jué)編碼是不可缺少的。 此外,Ruel等還發(fā)現(xiàn)野生型和突變型小鼠在研究的所有刺激頻率和強(qiáng)度下DPOAE都沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明兩者外毛細(xì)胞功能正常。野生型和雜合型小鼠均引出了ABR，純合突變型小鼠雖然也引出了ABR，但ABR振幅較雜合型小鼠明顯降低。

Obholzer等[26]敲除了斑馬魚(yú)VGLUT3外顯子2，外顯子2缺失能夠阻止mRNA翻譯成VGLUT3蛋白，發(fā)現(xiàn)突變體斑馬魚(yú)突觸小泡數(shù)量減少，突觸后動(dòng)作電流缺少。推測(cè)VGLUT3突變個(gè)體，毛細(xì)胞帶狀突觸中囊泡含有的谷氨酸水平降低，囊泡數(shù)量也減少，不足以在一級(jí)神經(jīng)元中產(chǎn)生動(dòng)作電位，最終導(dǎo)致毛細(xì)胞突觸信號(hào)傳遞缺陷。

以上研究提示VGLUT3蛋白在毛細(xì)胞突觸的谷氨酸傳遞中起重要作用。VGLUT3蛋白位于毛細(xì)胞突觸囊泡膜上，谷氨酸的攝取由三磷酸腺苷酶產(chǎn)生的質(zhì)子依賴的電化學(xué)梯度所驅(qū)動(dòng)，對(duì)底物L(fēng)-谷氨酸有著高度的特異性[30]，能特異裝載毛細(xì)胞胞漿中的谷氨酸進(jìn)入突觸囊泡內(nèi)[31]，突觸囊泡和突觸前膜接觸、融合，進(jìn)而通過(guò)胞吐作用，將谷氨酸釋放到突觸間隙。突觸間隙的谷氨酸作用于突觸后膜的谷氨酸受體，產(chǎn)生動(dòng)作電位，傳遞聽(tīng)覺(jué)信號(hào)(圖1a、b)。VGLUT3缺陷的個(gè)體，由于囊泡上谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)異常，進(jìn)入突觸囊泡內(nèi)的谷氨酸缺乏，進(jìn)而使釋放到突觸間隙的谷氨酸減少，毛細(xì)胞突觸傳遞缺陷，最終導(dǎo)致聽(tīng)力損失(圖1c)。這一機(jī)制與OTOF基因編碼的蛋白質(zhì)otoferlin十分相似，otoferlin蛋白特異表達(dá)在耳蝸和前庭毛細(xì)胞的突觸囊泡上，為一種鈣離子感應(yīng)器，在內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸處促使突觸囊泡與突觸前膜緊密融合，在內(nèi)毛細(xì)胞突觸囊泡的胞吐過(guò)程中發(fā)揮重要作用[32，33]，從而將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙，otoferlin蛋白缺陷個(gè)體這一谷氨酸傳遞過(guò)程受阻，成為聽(tīng)神經(jīng)病患者聽(tīng)力損失的致病原因[2]。由此可見(jiàn)，otoferlin 蛋白與 VGLUT3 蛋白均表達(dá)于突觸前囊泡膜上，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞與釋放，無(wú)論是VGLUT3還是otoferlin缺陷，最終都將會(huì)導(dǎo)致谷氨酸釋放到突觸間隙減少，影響谷氨酸的信號(hào)傳遞功能。研究已經(jīng)證明，otoferlin 蛋白改變與聽(tīng)神經(jīng)病的發(fā)病密切相關(guān)，臨床表現(xiàn)為非綜合征型聽(tīng)神經(jīng)病[2]，而VGLUT3蛋白與聽(tīng)神經(jīng)病的相關(guān)性，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

圖1 a.谷氨酸表達(dá)與功能示意圖；b.正常VGLUT3的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；c.突變體VGLUT3的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙機(jī)制

SLC17A8基因敲除小鼠表現(xiàn)為重度聽(tīng)力損失，DPOAE正常，ABR振幅降低，這也與聽(tīng)神經(jīng)病的臨床表現(xiàn)十分相似，結(jié)合otoferlin蛋白與VGLUT3蛋白相似的致病機(jī)制，推測(cè)VGLUT3 蛋白可能與聽(tīng)神經(jīng)病具有一定的相關(guān)性。

3 SLC17A8基因篩查情況

Ruel等[20]對(duì)家族1(捷克血統(tǒng)的美國(guó)家系)和家族1 490(德國(guó)血統(tǒng)的美國(guó)家系)進(jìn)行DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)SLC17A8基因是常染色體顯性遺傳、非綜合征型、感音神經(jīng)性聾的致病基因，表現(xiàn)為進(jìn)行性的高頻非綜合征型聽(tīng)力損失，其發(fā)病與年齡增長(zhǎng)密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的家系基因共分離，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)相同的雜合錯(cuò)義突變，即外顯子5的核苷酸改變(c.632C/T)，這一突變導(dǎo)致氨基酸改變(p.A211V)，而p.A211V突變?cè)?67例對(duì)照組中及單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)均未發(fā)現(xiàn)。蛋白質(zhì)p.A211V突變分子模型提示氨基酸殘基A211在第4和第5跨膜域之間的胞質(zhì)短交聯(lián)區(qū)域，這個(gè)突變位點(diǎn)位于SLC17A8基因編碼的囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(VGLUT3)的孔隙，纈氨酸替代了丙氨酸，可能會(huì)增加位阻現(xiàn)象，從而影響谷氨酸配體從胞漿進(jìn)入到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白孔隙，再進(jìn)入囊泡這一過(guò)程，最終造成了VGLUT3的功能障礙。

自2001年首次鑒定DFNA25 基因座，并于2008年發(fā)現(xiàn)編碼VGLUT3的SLC17A8 基因至今，國(guó)內(nèi)外對(duì)SLC17A8基因及其編碼蛋白VGLUT3的研究多集中于其表達(dá)分布和動(dòng)物模型研究，對(duì)人類SLC17A8基因篩查的研究較少，迄今為止，僅在美國(guó)患者中發(fā)現(xiàn)該基因的1種有致病意義的錯(cuò)義突變c.632C/T(圖2)。目前，尚未在中國(guó)聽(tīng)神經(jīng)病患者及其他耳聾患者中發(fā)現(xiàn)該基因的突變。

4 展望

雖然聽(tīng)神經(jīng)病分子遺傳學(xué)研究不斷取得新進(jìn)展，聽(tīng)神經(jīng)病相關(guān)基因不斷被發(fā)現(xiàn)，但仍存在許多尚未被發(fā)現(xiàn)的聽(tīng)神經(jīng)病相關(guān)基因。基因檢測(cè)可以為聽(tīng)神經(jīng)病的致病機(jī)制、病理分型、治療方式的選擇、預(yù)后提供理論依據(jù)。如OTOF基因突變的個(gè)體，由于內(nèi)毛細(xì)胞谷氨酸釋放障礙，表現(xiàn)為聽(tīng)覺(jué)突觸病變型聽(tīng)神經(jīng)病，進(jìn)行人工耳蝸手術(shù)治療可取得良好療效[34]。與OTOF作用機(jī)制相似的SLC17A8基因，是否也與OTOF基因一樣是聽(tīng)覺(jué)突觸病變型聽(tīng)神經(jīng)病的致病基因，對(duì)于SLC17A8基因?qū)е碌穆?tīng)力損失是否也可通過(guò)人工耳蝸手術(shù)取得良好療效，這些均有待于進(jìn)一步研究。

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